曾蓮　張華　柳絮等

摘要：以紅旗16為受體、明恢63為供體，經(jīng)雜交和回交得到BC4F1。利用643對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)所構(gòu)建的抽穗期基因早晚池和親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到4對(duì)多態(tài)性標(biāo)記。將篩選出的雜合單株進(jìn)行自交，獲得BC4F2，并從中篩選出抽穗期分離較明顯的群體進(jìn)行田間表型調(diào)查和基因型檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因與標(biāo)記PSM391連鎖，位于第7染色體長(zhǎng)臂末端，命名為Hd7m。在標(biāo)記PSM391與第7染色體末端之間合成10對(duì)新SSR標(biāo)記，其中多態(tài)性標(biāo)記RM22156與目標(biāo)基因相距4.1 cM。該結(jié)果為Hd7m基因的精細(xì)定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；抽穗期；基因定位；SSR標(biāo)記；遺傳分析

中圖分類號(hào)：S511：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0010-04

Abstract Using Hongqi 16 as the receptor and Minghui 63 as the donor， a BC4F1 segregation population was developed through cross between the two parents and backcross with Hongqi 16. The early heading gene pool， late heading gene pool， and the parents were analyzed with 643 pairs of SSR markers， and 4 pairs of polymorphic markers were obtained. BC4F2 populations derived from inbreeding of BC4F1 hybrid plants with obvious segregation phenotype were selected for field investigation and genotype detection. The results showed that the target gene， named Hd7m， was linked to SSR marker PSM391， which located at the end of chromosome 7. Based on the targeted interval， 10 pairs of new SSR markers were synthesized. Among which， the polymorphic marker RM22156 was apart from Hd7m of 4.1 cM. The results laid foundations for fine mapping， gene cloning and molecular marker assisted breeding of Hd7m.

Key words Rice； Heading date； Gene mapping； SSR marker； Genetic analysis

水稻是短日照植物，它的抽穗是通過(guò)光周期來(lái)調(diào)整的。抽穗期是水稻適應(yīng)環(huán)境變化最基本的農(nóng)藝性狀之一。水稻基因間互作及基因和環(huán)境間的互作使抽穗期的遺傳行為十分復(fù)雜。水稻復(fù)雜性狀遺傳學(xué)基礎(chǔ)的分類，不僅對(duì)水稻發(fā)展的基礎(chǔ)研究方面有很大的影響，對(duì)水稻育種也有實(shí)際的價(jià)值。隨著分子標(biāo)記技術(shù)和基因克隆技術(shù)的應(yīng)用，人們對(duì)水稻抽穗期遺傳機(jī)制的研究也逐漸深入，國(guó)內(nèi)外定位了700多個(gè)抽穗期QTL（http//www.gramene.org/qtl/index.html），分布在水稻12條染色體上，其中第3、6、7染色體上較多，第10染色體上較少。存在于不同位點(diǎn)上的QTL被檢測(cè)到的概率取決于自身的效應(yīng)大小，效應(yīng)較大的QTL被檢測(cè)到的概率較大[1]。

日本水稻基因組計(jì)劃（Rice Genome Research Program， RGP）Yano團(tuán)隊(duì)深入研究水稻的QTL，他們用秈粳交組合（Nipponbare/Kasalath）衍生的F2、回交重組自交系（Backcross recombinant inbred line，BIL）和高代回交群體定位了15個(gè)水稻抽穗期QTL：Hd1～Hd3a、Hd3b～Hd14[2]。其中，利用日本晴和Kasalath雜種F2代的186個(gè)植株和850多個(gè)分子標(biāo)記對(duì)影響水稻抽穗期的QTL進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)2個(gè)主效QTLs（Hd1和Hd2）和3個(gè)微效QTLs（Hd3、Hd4和Hd5）。其中主效Hd1位于第6染色體中部，另一個(gè)基因Hd2位于第7染色體末端[3]。利用日本晴作輪回親本，Kasalath作供體，分別構(gòu)建包含Hd1、Hd2和Hd3的近等基因系，并借助RFLP標(biāo)記對(duì)這3個(gè)QTLs進(jìn)行精細(xì)定位。其中，Hd1定位于水稻第6染色體RFLP標(biāo)記R1679和P130之間，并與C235共分離[1]。在Hd1和Hd2座位上，Kasalath等位基因均促進(jìn)抽穗，在Hd3、Hd4和Hd5座位上，Kasalath等位基因均推遲抽穗。分析表明，通過(guò)移除主效基因?qū)Ρ硇偷挠绊懣梢源龠M(jìn)微效基因的表達(dá)。在BC1F5群體中定位了5個(gè)抽穗期QTLs，其中效應(yīng)較大的2個(gè)，分別與Hd1和Hd2處于同一區(qū)間，另外3個(gè)QTLs（Hd7、Hd8和Hd11）的效應(yīng)較小[4，5]。以Nipponbare為輪回親本，對(duì)Nipponbare/Kasalath組合進(jìn)行多次回交和篩選，得到高世代回交群體，用上述遺傳背景較單一的回交群體，又檢測(cè)到兩個(gè)新的抽穗期QTLs：Hd6和Hd9，兩QTL的Kasalath等位基因都推遲水稻抽穗[6，7]。用上述高世代回交群體又定位了Hd4和Hd5，Hd4被定位在第7染色體上，在標(biāo)記R46和C39最近的區(qū)域之間；Hd5被定位在第8染色體短臂C166和R902之間，兩個(gè)QTLs均為單一的孟德爾因子。Hd5與Hd2在調(diào)節(jié)抽穗期上表現(xiàn)為加性效應(yīng)，表明Hd2與Hd5處在不同的光周期途徑中。光周期敏感因子Hd3作為與水稻抽穗期相關(guān)的QTL最初被定位于第6染色體上，為了驗(yàn)證Hd3的基因型，在長(zhǎng)日照和短日照兩種條件下分析BC4F2群體Hd3區(qū)段中20個(gè)重組單株的抽穗期，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段包含兩個(gè)影響抽穗期的基因，分別命名為Hd3a和Hd3b[8]。后來(lái)，在Nippobare/Kasalath衍生的高世代群體中又鑒定到了Hd10、Hd12、Hd13和Hd14共4個(gè)影響水稻抽穗期的QTLs[9]。endprint

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上克隆了大量與水稻抽穗期相關(guān)的基因，如Hd1、Hd2、Hd3a、Hd3b、RFT1、DTH8等，并研究它們對(duì)抽穗期調(diào)控的相互作用，為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)水稻抽穗期的相關(guān)研究提供了重要的參考依據(jù)。本試驗(yàn)所用的材料BC4F2為高世代回交重組自交群體，其抽穗期性狀穩(wěn)定遺傳，受1對(duì)等位基因（Hd7m）控制。本研究為Hd7m的精細(xì)定位、分子標(biāo)記輔助育種和基因克隆提供了重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以紅旗16為受體親本，以明恢63為供體親本，雜交得F1，以紅旗16為回交親本得BC4F1并收取種子。將回交得到的種子自交得BC4F2，從中選出抽穗期分離較明顯的群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植 試驗(yàn)在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心飲馬泉農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，2013年4月20日播種、6月2日插秧，同年篩選到抽穗期分離明顯的群體，編號(hào)R185。選擇R185中基因型均表現(xiàn)為雜合的單株種子，于2014年4月28日播種、6月1日插秧，同年篩選出抽穗期分離明顯的群體，編號(hào)LL。

1.2.2 田間抽穗期調(diào)查 每3天進(jìn)行一次田間調(diào)查，以單株的第一個(gè)穗子抽出1 cm作為抽穗日，以播種日至抽穗日的天數(shù)作為抽穗期，對(duì)親本、回交群體每個(gè)單株進(jìn)行抽穗期記載。

1.2.3 水稻DNA的提取及SSR分子標(biāo)記分析 用TPS法提取水稻DNA備用。用BSA法[10]分別構(gòu)建抽穗期DNA早晚池。根據(jù)網(wǎng)上（http： // www.gramene.org）已發(fā)表的標(biāo)記序列合成SSR標(biāo)記。PCR擴(kuò)增按照Panaud等（1996）的方法[11]進(jìn)行部分修改后使用。配置20.5 μL反應(yīng)體系，包括2 μL DNA模板、0.1 μL dNTP、2 μL 10×buffer、13.2 μL ddH2O、0.2 μL Taq酶、3 μL 10 μmol/L引物。PCR儀擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色，記錄單株帶型結(jié)果，拍照保存。

1.2.4 用早熟單株定位Hd7m在染色體上的位置 結(jié)合田間表型對(duì)基因型進(jìn)行分析。用篩選出的4對(duì)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)早熟的97個(gè)單株逐個(gè)進(jìn)行基因型檢測(cè)，計(jì)算分離群體的重組率，C=（N1+N2/2）/N，其中N為早熟純合基因型的總株數(shù)，N1為晚熟純合基因型的總株數(shù)，N2為雜合基因型的總株數(shù)[12]。用MapDraw對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離群體的表型及遺傳分析

明恢63抽穗期為114天，紅旗16抽穗期為120天。選用次級(jí)分離群體中抽穗期分離較明顯的群體LL，其抽穗期在95～143天，呈雙峰分布（圖1），以107天為分界?？ǚ椒治霰砻鳎琇L早抽穗植株和晚抽穗植株數(shù)目的分離比符合1∶3 （χ2=0.72<χ20.05，1=3.84，表1）[2]。因此，認(rèn)為分離群體的抽穗期受1對(duì)等位基因控制，且晚抽穗對(duì)早抽穗表現(xiàn)為完全顯性。

2.2 目標(biāo)基因的定位

利用合成的643對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)親本及所構(gòu)建的基因早晚池進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到多態(tài)性標(biāo)記PSM353、RM505、RM18和PSM391。因LL群體中晚熟植株數(shù)量較大且抽穗期較分散，因此，選用早熟的97個(gè)單株作為定位群體，用4對(duì)標(biāo)記對(duì)LL群體單株進(jìn)行基因型驗(yàn)證（以LL002和LL003群體為例，圖2、3）。經(jīng)重組率計(jì)算，目標(biāo)基因離4對(duì)標(biāo)記的遺傳距離分別為38、34、26.8 cM和13.4 cM。根據(jù)物理圖譜和田間表型分析，目標(biāo)基因位于PSM391與第7染色體末端之間，命名為Hd7m。

為了能將Hd7m基因限定在更小的范圍內(nèi)，在標(biāo)記PSM391與第7染色體末端區(qū)域間合成了10對(duì)新標(biāo)記，對(duì)親本及基因早晚池進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到多態(tài)性標(biāo)記RM22156。用標(biāo)記RM22156對(duì)LL分離群體中97個(gè)早熟單株進(jìn)行驗(yàn)證（圖4）。通過(guò)重組率計(jì)算，Hd7m與標(biāo)記RM22156相距4.1 cM（圖5）。

3 討論與結(jié)論

抽穗期是影響水稻品種栽培地區(qū)和栽培季節(jié)的重要農(nóng)藝性狀，對(duì)水稻抽穗期基因進(jìn)行精細(xì)定位，有助于抽穗期基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同的水稻品種進(jìn)行了抽穗期QTL的定位與克隆的研究，通過(guò)構(gòu)建不同QTL的近等基因系，對(duì)Hd1、Hd2、Hd3、Hd6和Hd9進(jìn)行了精細(xì)定位分析，其中Hd2定位于第7染色體末端，距RFLP標(biāo)記C586為0.5 cM[6，13，14]，是OsPRR37的同源基因[15，16]，OsPRR37的位置為29617430-29628600 bp[2]。本試驗(yàn)定位的Hd7m與第7染色體標(biāo)記RM22156相距4.1 cM，根據(jù)網(wǎng)站（http： //www.gramene.org）得到RM22156的位置為29146343-29146365 bp（C586的位置為29267487-29268073 bp）。Hd7m與OsPRR37和C586分別相距1.9 cM和0.5 cM。推測(cè)該基因可能與Hd2等位，然而，二者是否是同一基因，需要經(jīng)精細(xì)定位或等位性分析才能得到證實(shí)。

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，LL次級(jí)分離群體的抽穗期出現(xiàn)早晚極端表現(xiàn)型，早抽穗植株和晚抽穗植株數(shù)目的分離比符合1∶3，推測(cè)該次級(jí)分離群體抽穗期受1對(duì)等位基因控制，且控制早抽穗的等位基因來(lái)自供體明恢63，控制晚抽穗的等位基因來(lái)自受體紅旗16。在本試驗(yàn)進(jìn)程中，因種植地的面積限制、環(huán)境與基因間的互作和該性狀遺傳基礎(chǔ)的復(fù)雜性等各方面的影響，需要對(duì)已有試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證和進(jìn)一步試驗(yàn)的補(bǔ)充才能得到更精確的結(jié)果，為Hd7m的精細(xì)定位和克隆提供重要信息。

參 考 文 獻(xiàn)：endprint

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