李文　劉風(fēng)珍　萬(wàn)勇善等

摘要：本研究從33個(gè)花生栽培品種中克隆獲得干旱脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因PNDREB1，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，33個(gè)栽培品種PNDREB1的核苷酸序列同源性為100%，并構(gòu)建了植物表達(dá)載體pGBDREB1，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；DREB1；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：S565.2：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0006-04

Abstract In this research， drought stress responsive transcription factor gene PNDREB1 were cloned from 33 peanut cultivars. Sequence analysis showed that the nucleotide sequence homology of PNDREB1 from 33 peanut cultivars was 100%. The plant expression vector pGBDREB1 was also constructed， which laid foundations for further research of the gene.

Key words Peanut； DREB1； Plant expression vector

花生（Arachis hypogaea L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占重要地位。我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)主要分布于干旱半干旱的丘陵地區(qū)，花生生長(zhǎng)期間常受到不同程度的干旱脅迫，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[1]，是花生生產(chǎn)的首要限制因子。

干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（dehydration responsive element binding protein，DREB）屬于AP2/EREBP（乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白）家族，含有高度保守的AP2區(qū)域，該區(qū)域特異性地與啟動(dòng)子中的DRE/CRT順式作用元件結(jié)合，激活逆境相關(guān)基因的表達(dá)，提高作物的抗性。自Liu等[2]從擬南芥中分離到轉(zhuǎn)錄因子基因DREB1A和DREB2A，并發(fā)現(xiàn)該類基因的過(guò)表達(dá)可以有效提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性以來(lái)，DREB基因已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點(diǎn)。在水稻[3]、小麥[4]、玉米[5]、高粱[6]、白菜[7]、棉花[8]等作物中陸續(xù)有多個(gè)DREB基因被分離鑒定。Wang等[4]將DREB基因轉(zhuǎn)化到小麥中，轉(zhuǎn)基因小麥抗旱性明顯升高，脯氨酸含量是對(duì)照的2倍。王曉飛[9]將大豆DREB基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株抗旱性增強(qiáng)，其脯氨酸含量、可溶性糖含量升高，丙二醛含量降低。

張梅等[10]從花生栽培品種魯花14未成熟種子的cDNA文庫(kù)中分離到一個(gè)DREB類基因——PNDREB1（FM955403）。該基因序列長(zhǎng)度為687 bp，推測(cè)編碼蛋白含有229個(gè)氨基酸殘基，其AP2結(jié)構(gòu)域具有和DRE元件特異性結(jié)合的能力，其C-末端片段具有轉(zhuǎn)錄激活活性，利用半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)模式分析顯示，PNDREB1為組成型表達(dá)，能夠被低溫強(qiáng)烈、迅速誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)干旱脅迫也有一定程度的響應(yīng)，但不能響應(yīng)高鹽和ABA信號(hào)。本研究克隆了33個(gè)花生栽培品種的DREB1基因，對(duì)其進(jìn)行了序列多態(tài)性分析，并構(gòu)建PNDREB1超表達(dá)的植物表達(dá)載體，為今后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)一步了解花生DREB1在響應(yīng)干旱脅迫中的功能提供材料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

供試材料為33個(gè)花生栽培品種（表1），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究所提供。

植物表達(dá)載體pGBVE質(zhì)粒和農(nóng)桿菌菌株LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ購(gòu)自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ和T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo公司。TIANgel膠回收試劑盒、TIAN prep質(zhì)粒小提試劑盒、RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant RT Kit（with gDNase）購(gòu)自天根生化科技有限公司；pEASY-T1 Vector、大腸桿菌菌株Trans1-T1、Eazy Taq高保真酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DL2000和DL5000 DNA Maker購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由上海生物工程有限公司合成，測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生葉片總DNA提取 采用CTAB法提取花生幼嫩葉片的基因組DNA。

1.2.2 花生葉片總RNA提取 按照天根植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明書并加以優(yōu)化提取花生葉片總RNA，并用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 花生DREB1基因的擴(kuò)增 根據(jù)花生PNDREB1（FM955403）序列設(shè)計(jì)引物[9]DREBF：5′-ATGGACGTGGACCCG C-3′，DREBR：5′-GTTAGTAGGGAACTGACT CC-3′；以33個(gè)栽培品種基因組DNA和cDNA為模板，擴(kuò)增PNDREB1的基因序列。PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 50 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中進(jìn)行抗卡那霉素篩選。挑選陽(yáng)性單菌落，PCR檢測(cè)鑒定后送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，每個(gè)栽培品種選6～7個(gè)克隆。

1.2.5 PNDREB1植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以植物表達(dá)載體pGBVE為基礎(chǔ)，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，以PNDREB1基因片段代替γ-TMT（γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因）構(gòu)建由組成型啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)PNDREB1表達(dá)的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，篩選鑒定得到陽(yáng)性克隆。植物表達(dá)載體構(gòu)建路線圖見圖1。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 PNDREB1基因的克隆

用引物DREBF和DREBR分別對(duì)山花11號(hào)基因組DNA和cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均獲得約700 bp的特異性條帶（圖2），經(jīng)克隆、測(cè)序獲得PNDREB1的序列，PNDREB1基因全長(zhǎng)687 bp，無(wú)內(nèi)含子，編碼蛋白包括229個(gè)氨基酸。

分別以33個(gè)花生栽培品種的基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測(cè)序檢測(cè)，每個(gè)栽培品種均得到一條PNDREB1 DNA序列，序列一致性為100%。

2.2 PNDREB1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測(cè)

根據(jù)PNDREB1基因片段和pGBVE質(zhì)粒序列特征以及pEASY-T1克隆載體所攜帶的限制性內(nèi)切酶的種類，選擇BamHⅠ和NotⅠ作為雙酶切的限制性內(nèi)切酶。酶切后pEASY-T1片段大小分別約為700 bp和3.9 kb，pGBVE分別為5 kb和2 kb，大小與預(yù)期相符。

將目的基因片段和質(zhì)粒大片段分別回收、純化，用T4 DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示PNDREB1基因的正向序列已經(jīng)替換了pGBVE質(zhì)粒上的γ-TMT基因（圖3），花生DREB1的過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pGBDREB1。

重組質(zhì)粒pGBDREB1以凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出陽(yáng)性克隆。用引物DREBF/R對(duì)陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到700 bp左右的特異性條帶（圖4），表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

3 討論

本研究克隆到的PNDREB1基因，全長(zhǎng)687 bp，無(wú)內(nèi)含子，編碼229個(gè)氨基酸，與參考序列PNDREB1（FM955403）完全一致?；ㄉ耘喾N是異源四倍體（AABB），由兩個(gè)具有不同染色體組的二倍體野生種通過(guò)自然雜交，再經(jīng)一次性加倍事件進(jìn)化形成[14]。本研究在每個(gè)栽培種花生中只分離到一條PNDREB1序列，且33個(gè)栽培品種序列高度保守，推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子在植物中行使著非常重要的功能。

根據(jù)PNDREB1基因片段和pGBVE質(zhì)粒序列特征以及pEASY-T1克隆載體所攜帶的限制性內(nèi)切酶的種類，本研究選用BamHⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，將γ-TMT基因切除，成功構(gòu)建了帶有Bar基因、由組成型啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)的PNDREB1的植物表達(dá)載體pGBDREB1，并將重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，獲得了陽(yáng)性菌株，可用于花生遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，為下一步研究PNDREB1基因的功能奠定了基礎(chǔ)，為花生的抗旱育種提供了材料。

參 考 文 獻(xiàn)：

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