趙麗　張國嘉　鄭世剛等

摘要：水稻類受體蛋白激酶OsESG1在種胚中特異表達(dá)，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。OsESG1基因全長cDNA經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切，與同樣經(jīng)雙酶切的原核表達(dá)載體pET-28a（+）經(jīng)T4 DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21。原核表達(dá)結(jié)果顯示，OsESG1可受1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，且蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的延長而逐漸增加，誘導(dǎo)7 h后，蛋白表達(dá)至較高水平。對不同濃度IPTG誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，0.1 mmol/L IPTG對OsESG1的誘導(dǎo)表達(dá)效果最好。

關(guān)鍵詞：類受體蛋白激酶；OsESG1；原核表達(dá)

中圖分類號：S511.01：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0001-05

Abstract Rice receptor-like kinase OsESG1 belongs to serine/threonine protein kinase， which is specifically expressed in rice embryo. In this research， the full length cDNA of OsESG1 was digested by BamH Ⅰ and XhoⅠ， and then linked with the prokaryotic expression vector pET-28a（+） digested by the same double enzymes with T4 DNA ligase. The constructed prokaryotic expression vector of OsESG1-pET-28a（+） was then transformed into host bacteria BL21 for protein expression analysis. The SDS-PAGE showed that OsESG1 could be induced to express by 1 mmol/L IPTG. The expression quantity increased with the elongation of induction time， and reached the maximum level after inducing for 7 h. The induction concentration of IPTG was also studied. The results indicated that 0.1 mmol/L IPTG had the best induction effect.

Key words Receptor-like kinase； OsESG1； Prokaryotic expression

植物細(xì)胞具有感受生物和非生物脅迫的能力，并可通過細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)途徑，將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，對胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程進(jìn)行調(diào)控，從而使機(jī)體對胞外信號做出一定的響應(yīng)。類受體蛋白激酶（Receptor Like Kinases，RLKs）廣泛存在于植物中，可通過胞外結(jié)構(gòu)域識別信號分子，進(jìn)而通過磷酸化與去磷酸化反應(yīng)，將信號傳遞至下游靶蛋白，調(diào)控相關(guān)生理、生化過程。

自1989年Lawton等首次在四季豆中成功克隆到植物蛋白激酶基因PVPK-1[1]，之后cdc2、ZmPK1等類受體蛋白激酶基因也相繼被克隆，相關(guān)功能研究也受到普遍關(guān)注。根據(jù)胞外結(jié)構(gòu)域的不同，類受體蛋白激酶主要分為六個亞家族：S-結(jié)構(gòu)域類受體蛋白激酶、富亮氨酸類受體蛋白激酶、表皮生長因子類受體蛋白激酶、凝集素類受體蛋白激酶、腫瘤壞死因子類受體蛋白激酶、PR5 類受體蛋白激酶[2]。植物類受體蛋白激酶作用廣泛，主要參與激素的應(yīng)答[3]、植物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)[4]、自交不親和[5]、病原菌的識別[6]以及共生[7]等過程。

本實驗室前期從水稻中克隆了一個類受體蛋白激酶基因，命名為OsESG1（Oryza Sativa Embryo Specific Gene 1），GenBank序列號為HE584611.1[8]。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，OsESG1包括胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域、跨膜域、胞外受體結(jié)構(gòu)域三個部分，根據(jù)其胞外結(jié)構(gòu)特征，屬S-結(jié)構(gòu)域類受體蛋白激酶。初步表達(dá)模式分析顯示該激酶表達(dá)具有種胚特異性[9]。本研究將OsESG1基因編碼區(qū)與原核表達(dá)載體pET-28a（+） 融合，獲得重組質(zhì)粒OsESG1-pET-28a（+） ，測序正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3） 感受態(tài)中，進(jìn)行原核表達(dá)，并對蛋白誘導(dǎo)條件及表達(dá)情況進(jìn)行了優(yōu)化及鑒定，為進(jìn)一步在生化水平上解析該基因的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

pET-28a（+） 載體由本實驗室保存；前期試驗已獲得測序正確的OsESG1克隆質(zhì)粒；大腸桿菌（E.coli）的DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；高純質(zhì)粒回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 OsESG1全長序列的擴(kuò)增

根據(jù)OsESG1的基因序列以及pET-28a（+） 的酶切位點，利用Primer premier 5.0設(shè)計引物：OsESG1-BamHⅠ-S：5′-CGGGATCCTTTGTGGATAGCTATGTTGCAGTTG-3′、OsESG1-XhoⅠ-A：5′ –CCCTCGAGATCAATCATAATCGTCCATCAGGTT-3′（下劃線處分別為BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點）。以O(shè)sESG1克隆質(zhì)粒為模板，利用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到OsESG1的DNA全長。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Ex Taq premix 25 μL、克隆質(zhì)粒 2.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1.25 μL、ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56.5℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。endprint

1.3 OsESG1-pET-28a（+） 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將OsESG1的PCR產(chǎn)物與pET-28a（+） 質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，1%凝膠電泳檢測并回收純化酶切產(chǎn)物。pET-28a（+） 和OsESG1的回收產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，條帶大小正確后，在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置避光培養(yǎng)12 h。

隨機(jī)挑取菌斑進(jìn)行XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切以及菌液PCR鑒定。將檢測正確的單克隆用載體引物T7進(jìn)行測序驗證，測序由山東省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心測序室完成。

將測序正確的OsESG1-pET-28a（+） 重組質(zhì)粒以熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）內(nèi)，經(jīng)菌液PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化子，用于進(jìn)一步的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。

1.4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)以及SDS-PAGE

1.4.1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將含有OsESG1-pET-28a（+） 的菌液按1∶100的比例接種含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，搖菌至菌液OD值在0.6到1.0之間。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG（isopropyl β-D-thiogalactoside），25℃下誘導(dǎo)12 h。

誘導(dǎo)后的菌液用10 mmol/L溶菌酶裂解后，經(jīng)離心，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測OsESG1的表達(dá)情況 。

1.4.2 不同誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)的影響 在25℃條件下，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，每隔1個小時取樣備用，樣品經(jīng)溶菌酶處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的最佳誘導(dǎo)時間。

1.4.3 不同誘導(dǎo)濃度對蛋白表達(dá)的影響 分別使用0.001、0.01、0.1、1、10 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，不同樣品經(jīng)溶菌酶處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定融合蛋白的最佳誘導(dǎo)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsESG1全長序列的擴(kuò)增

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得OsESG1的全長序列，約2 200 bp，與本實驗室前期獲得的基因大小一致（圖1）。

2.2 OsESG1-pET-28a（+） 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

OsESG1全長序列與pET-28a（+） 質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收純化后以T4 DNA酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)Kan抗性篩選挑取陽性克隆，經(jīng)菌液PCR獲得約2 200 bp的片段（圖2A），重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約2 200、5 300 bp的片段（圖2B），與預(yù)期相符。菌液PCR與質(zhì)粒雙酶切結(jié)合測序結(jié)果，顯示OsESG1已經(jīng)被正確連接到pET-28a（+）載體上，原核表達(dá)載體OsESG1-pET-28a（+）構(gòu)建成功，載體圖譜如圖3所示。

將OsESG1-pET 28a（+）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，隨機(jī)挑取菌斑進(jìn)行PCR檢測，均獲得陽性條帶，表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中（圖4）。

2.3 原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及SDS-PAGE電泳

含有重組質(zhì)粒的菌液，經(jīng)1 mmol/L IPTG在25℃下誘導(dǎo)12 h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒與空載體的菌液上清之間電泳條帶差別不明顯，含重組質(zhì)粒的菌液沉淀電泳后出現(xiàn)一條將近80 kD的蛋白條帶（圖5），而含空載體的菌液沉淀未出現(xiàn)類似條帶，表明OsESG1在宿主菌BL21內(nèi)可被誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)的蛋白產(chǎn)物主要存在于菌液的沉淀中，在上清中含量較少。推測該基因的蛋白產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。

分別取經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時間的菌液，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)1 h，幾乎檢測不到誘導(dǎo)帶，隨著誘導(dǎo)時間的延長，OsESG1在菌液內(nèi)的表達(dá)量逐漸上升，并在誘導(dǎo)7 h后達(dá)到較高的表達(dá)水平，之后蛋白質(zhì)的表達(dá)量趨于穩(wěn)定（圖6A）。

以不同IPTG濃度誘導(dǎo)的菌液為樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示，0.001 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量很低，隨著IPTG濃度升高，開始出現(xiàn)誘導(dǎo)的蛋白條帶，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.1 mmol/L時，出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，此后隨著IPTG濃度的提高，蛋白的表達(dá)量沒有明顯的變化（圖6B）。

3 結(jié)論與討論

外源基因表達(dá)系統(tǒng)已是生物研究中普遍使用的方法。目前常見的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。相對于酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞等真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)既是最常用的表達(dá)系統(tǒng)，也最經(jīng)濟(jì)實惠。其中以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為代表，是蛋白表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早的表達(dá)系統(tǒng)[10]。該表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點[11]。雖然存在蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機(jī)制，影響如二硫鍵形成、蛋白糖基化和正確折疊等問題，且得到具有生物活性蛋白的幾率較小等缺點，但仍是目前應(yīng)用最廣的經(jīng)典蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

目前已有多個水稻基因利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得蛋白表達(dá)產(chǎn)物。2009年，戈林泉等克隆了水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS并成功進(jìn)行了原核表達(dá)[12]；2011年，秦圣光等成功表達(dá)了水稻YTB中OSVDAC5蛋白并以蛋白產(chǎn)物制備了抗體[13]；2013年，楊加偉等成功表達(dá)了水稻Osε-cop1基因并制備了抗體[14]。水稻類受體蛋白激酶基因也有在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的先例，2008年，程彥偉等利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了一個水稻LRR型類受體蛋白激酶胞外區(qū)，并成功制備了抗體[15]。由于外源蛋白表達(dá)量過大且沒有足夠的酶對中間體進(jìn)行折疊加工，導(dǎo)致大多數(shù)蛋白通常以無活性包涵體的形式存在，這種情況下，包涵體中的蛋白質(zhì)依然可以通過His純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，且包涵體中的蛋白對抗體的制備并不造成影響。endprint

本研究在前期獲得OsESG1基因全長cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用經(jīng)典的pET表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體OsESG1-pET-28a（+），并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）內(nèi)。在初步獲得原核蛋白表達(dá)產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對OsESG1在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，在經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)7 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到較高水平；且0.1 mmol/L IPTG可誘導(dǎo)蛋白適量表達(dá)，為最佳誘導(dǎo)濃度。本試驗中，由于OsESG1的蛋白表達(dá)產(chǎn)物主要出現(xiàn)在菌液的沉淀部分，推測其主要以包涵體的形式存在，不易溶解于菌液上清，這也是基因進(jìn)行原核蛋白表達(dá)時常見的問題，也使蛋白質(zhì)的生物活性受到很大影響。下一步將在優(yōu)化蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對蛋白進(jìn)行分離純化，爭取獲得純度以及濃度較高的OsESG1，為進(jìn)一步研究類受體蛋白激酶的活性劑理化功能、分析高級結(jié)構(gòu)以及激酶活性檢測及抗體制備等奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]Lawton M A，Yamamoto R T， Hanks S K， et al. Molecular cloning of plant transcripts encoding protein kinase homologs[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1989， 86（9）：3140-3144.

[2]閆峰，祝傳書，龐保平.植物類受體蛋白激酶的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報， 2009， 29（4）： 851-858.

[3]Clouse S. Brassinosteroid signal transduction： clarifying the pathway from ligand perception to gene expression[J]. Molecular Cell， 2002， 10（5）：973-982.

[4]Lally D， Ingmire P， Tong H Y， et al. Antisense expression of a cell wall associated protein kinase， WAK4， inhibites cell elongation and alters morphology [J]. The Plant Cell， 2001， 13（6）： 1317-1331.

[5]Hiscock S J， Kües U， Dickinson H G. Molecular mechanisms of self-incompatibility in flowering plants and fungi different means to the same end[J]. Trends in Cell Biology， 1996， 6（11）：421-428.

[6]Gomez-Gomez L， Bauer Z， Boller T. Both the extracellular leucine-rich repeat domain and the kinase activity of FLS2 are required for flagellin binding and signaling in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2001， 13（5）：1155-1164.

[7]Endre G， Kereszt A， Devei Z， et al. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development[J]. Nature， 2002， 417（6892）：962-966.

[8]房孝良.水稻中配特異性基因OsESG1及其啟動子的研究 [D]. 濟(jì)南：山東師范大學(xué)， 2012.

[9]房孝良，劉煒，安靜，等. 水稻種胚特異性啟動子OsESP1的克隆及其表達(dá)特性[J].作物學(xué)報，2011， 37（10）： 1904-1909.

[10]Larrick J W， Thomas D W. Producing proteins in transgenic plant and animals [J]. Current Opinion in Biotechnology，2001，12（4）：411-418.

[11]Shamik S S， Frederick R B， Sarah W H. Recombinant protein production in an Escherichia coli reduced genome strain [J]. Metabolic Engineering， 2006， 9（2）： 133-141.

[12]戈林泉，周國鑫，王祺，等. 水稻β-石竹烯合成酶基因OsCAS的克隆鑒定、原核表達(dá)及其遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報， 2009， 35（4）： 365-371.

[13]秦圣光，程鋼，劉學(xué)群，等.水稻 YTB 中 OSVDAC5 蛋白的原核表達(dá)與抗體制備[J]. 生物技術(shù)，2011，21（4）：26-29.

[14]楊加偉， 周玲艷， 莊楚雄. 水稻Osε-cop1基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013， 32（4）：497-502.

[15]程彥偉，李亮，沈嶸，等.水稻 LRR 型類受體蛋白激酶胞外區(qū)的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2008， 35（9）：1077-1083.endprint