林茂 李進(jìn)華 唐慶

摘?要：為優(yōu)化油麻藤屬植物的種子滅菌方式，篩選油麻藤屬種子最佳的滅菌方式，為其組培快繁技術(shù)的建立提供基礎(chǔ)。以4種油麻藤屬植物的種子為外植體，以酒精、次氯酸鈉、升汞的浸泡時間為三因素，通過三因素三水平的正交試驗，篩選出油麻藤外植體的最佳滅菌方式。結(jié)果表明：美葉油麻藤滅菌的最優(yōu)處理為酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10～15 min;白花油麻藤滅菌的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10～15 min，再用升汞15 min;大果油麻藤獲低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，獲高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞15 min;常春油麻藤獲低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，獲高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10 min。結(jié)果表明不同種的油麻藤屬植物的種子滅菌最優(yōu)組合有所不同。

關(guān)鍵詞：油麻藤屬;外植體;正交試驗;滅菌

中圖分類號：S 72?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2019）10-007

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.10.007

Abstract： In order to optimize the sterilization method of the seeds of Mucuna plants， the best sterilization method of the seeds of Mucuna plants was screened to provide the basis for the establishment of the tissue culture rapid propagation technology. Taking the seeds of four kinds of Mucuna plants as explants and the soaking time of alcohol， sodium hypochlorite and mercury bichloride as three factors， the best sterilization method of Mucuna explants was selected through the orthogonal test of three factors and three levels. The results showed that the optimal treatment for the sterilization of Mucuna calophylla was 60 s of alcohol followed by 10 min of sodium hypochlorite and then 10-15 min of mercury bichloride. The optimal treatment for the sterilization of Mucuna birdwoodiana Tutcher was 60 s of alcohol followed by 10-15 min of sodium hypochlorite and then 15 min of mercury bichloride. The optimal combination for the low pollution rate of Mucuna macrocarpa was sodium hypochlorite for 15 min after 40 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min， while the optimal combination for the high germination number was sodium hypochlorite for 10 min after 60 s of alcohol and then mercury bichloride for 15 min. The optimal combination for the low pollution rate of Mucuna sempervirens was sodium hypochlorite for 15 min after 40 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min， while the optimal combination for the high germination number was sodium hypochlorite for 10 min after 60 s of alcohol and then mercury bichloride for 10 min. The results showed that the optimal combinations of seed sterilization were different in different species of Mucuna plants.

Key words： Mucuna; Explant; Orthogonal test; Sterilization

油麻藤屬植物主要分布在我國的熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有15種，資源極其豐富[1]。該屬植物具有適應(yīng)性強、生長快的優(yōu)點，同時還兼具較高的觀賞價值和重要的藥用價值[2-4]，應(yīng)用前景廣闊。隨著市場對油麻藤屬種苗需求的增加，加快優(yōu)質(zhì)種苗的生產(chǎn)變得尤為重要。組培快繁的繁殖系數(shù)高、周期短、不受季節(jié)和氣候條件的限制，是種苗規(guī)模化生產(chǎn)的有效途徑。油麻藤屬植物為木本植物，通過莖段、葉片等為外植體來建立快繁體系存在較大難度，通過種子無菌萌發(fā)來建立快繁體系則相對容易。種子滅菌是組培快繁的第一步，滅菌效果的好壞直接影響著下一步進(jìn)程。因此，開展油麻藤屬植物的種子滅菌研究極具實踐意義，可為組培快繁的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

目前關(guān)于油麻藤屬植物的研究主要集中在地理分布[5]、栽培[6-7]、資源開發(fā)應(yīng)用[8-9]以及人工繁殖[10-12]上，而關(guān)于其組培快繁的研究報道較少，僅有游云飛[13]進(jìn)行了研究，并以不同月份采集的不同成熟程度的莢果種子為外植體成功建立了離體再生體系。雖然已有許多植物的組織培養(yǎng)的相關(guān)報道，但關(guān)于外植體滅菌的研究并不多，通過正交試驗設(shè)計進(jìn)行的外植體滅菌研究就更少了。目前，已有土沉香[14]、大花序桉[15]、番茄[16]、云南甜龍竹、黃竹[17]的外植體滅菌是通過正交試驗設(shè)計的方法獲得的。正交試驗設(shè)計在油麻藤屬植物的種子滅菌未見有報道。雖已有游云飛[13]進(jìn)行了常春油麻藤的離體再生體系研究，但其種子滅菌處理為單因素試驗。正交試驗設(shè)計能更高效率、快速、經(jīng)濟地篩選出最優(yōu)組合，有利于建立油麻藤屬植物的組培快繁體系，以實現(xiàn)其優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)模生產(chǎn)。為探討油麻藤屬植物種子滅菌的最佳處理方式，本試驗以4種油麻藤屬植物的種子為外植體，以酒精、次氯酸鈉、升汞為因素，以其不同的浸泡時間為因素水平，通過三因素三水平的正交試驗設(shè)計，篩選出4種油麻藤屬植物的種子最佳滅菌方式，為其組培快繁體系的建立以及今后的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試的4種油麻藤分別為美葉油麻藤、白花油麻藤、大果油麻藤、常春油麻藤，種子均由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院提供。材料選擇籽粒飽滿、大小均勻的種子（表1）。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗設(shè)計?采用L9（34）正交表，以3種不同滅菌劑為試驗因素、滅菌劑的浸泡時間為因素水平（表2），按照表3的處理進(jìn)行試驗，每個處理的種子數(shù)為15粒，重復(fù)3次。研究各因素對種子滅菌成活以及萌發(fā)的影響，并對結(jié)果進(jìn)行多重比較、極差、方差分析，以確定油麻藤種子滅菌的最優(yōu)條件。

1.2.2?滅菌操作?將種子在中性洗滌劑中浸泡10～15 min后，在自來水下沖洗30 min。滅菌操作過程在超凈工作臺上進(jìn)行。按照表2的處理方式進(jìn)行種子滅菌：將種子在消毒劑A中浸泡一定的時間，無菌水沖洗3遍;然后在消毒劑B中浸泡一定的時間，無菌水沖洗3遍;再在消毒劑C中浸泡一定的時間，無菌水沖洗3遍。最后接入MS培養(yǎng)基中，在溫度23～25℃的條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。每天觀察種子的污染、萌發(fā)情況，連續(xù)觀察15 d，最后統(tǒng)計污染數(shù)、成活數(shù)、萌發(fā)數(shù)，并計算污染率。

污染率（%）=污染種子數(shù)/接種數(shù)×100

1.3?統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用Excel 2003統(tǒng)計處理，方差分析及Duncan′s多重比較采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同處理對4種油麻藤種子滅菌效果的影響

從表4可以看出，不同種類中不同處理的滅菌效果有所不同。在美葉油麻藤中，處理7的污染率顯著低于處理1和處理6，但與其他處理無顯著差異;處理7的萌發(fā)數(shù)僅次于處理2的萌發(fā)數(shù)，兩者無顯著差異。在白花油麻藤、大果油麻藤中，處理9的污染率最低，但萌發(fā)數(shù)并不是最高的，白花油麻藤的萌發(fā)數(shù)與其他8個處理無顯著差異，大果油麻藤的萌發(fā)數(shù)與除處理1外的其余7個處理無顯著差異。在常春油麻藤中，處理4的污染率最低，萌發(fā)數(shù)以處理7的最多，但與其余8個處理的萌發(fā)數(shù)無顯著差異。由上可知，在正交試驗的9個處理中，不同油麻藤屬植物的種子污染率、萌發(fā)數(shù)各不相同。

2.2?試驗的方差分析

通過表5的方差分析可知，不同滅菌劑對4種油麻藤屬植物種子滅菌影響如下：在美葉油麻藤、白花油麻藤、大果油麻藤中，僅有升汞對污染率、萌發(fā)數(shù)存在顯著差異，而酒精和次氯酸鈉對這3種油麻藤的污染率、萌發(fā)數(shù)無顯著差異;在常春油麻藤中，升汞對污染率的影響存在顯著差異，對萌發(fā)數(shù)的影響無顯著差異，酒精和次氯酸鈉對常春油麻藤的污染率、萌發(fā)數(shù)均無顯著差異。由此可知，酒精和次氯酸鈉對4種油麻藤的污染率、萌發(fā)數(shù)的影響不大;升汞對4種油麻藤的污染率的影響較大，在萌發(fā)數(shù)的影響上，除了對常春油麻藤的影響不大外，對其余3種的萌發(fā)數(shù)均有顯著影響。

2.3?各因素的多重比較

通過表6的各因素多重比較分析可知，在5%的顯著水平上，不論哪一種油麻藤，酒精、次氯酸鈉的各水平對污染率、萌發(fā)數(shù)均無顯著影響，僅有升汞的影響顯著。升汞對4種油麻藤污染率的影響趨勢一致，在污染率上，水平1顯著高于水平2和水平3，水平2和水平3無顯著差異。在萌發(fā)數(shù)上，升汞的影響因物種不同而不同：在美葉油麻藤、大果油麻藤中，水平1顯著低于水平2和水平3，水平2和水平3無顯著差異，其中美葉油麻藤水平2的萌發(fā)數(shù)最多，大果油麻藤水平3的萌發(fā)數(shù)最多;在白花油麻藤中，水平1顯著低于水平3，水平2和水平3無顯著差異;在常春油麻藤中，3個水平無顯著差異。由上可知，升汞對滅菌效果的影響大于酒精和次氯酸鈉。

2.4?各因素主次效應(yīng)分析

極差的大小反映了因素對測定指標(biāo)影響的大小，值越大則表明該因素越重要。通過表7的極差分析可知，在美葉油麻藤中，各因素對污染率影響的主次水平為升汞>酒精>次氯酸鈉，對萌發(fā)數(shù)影響的主次水平為升汞>次氯酸鈉>酒精。在白花油麻藤、大果油麻藤和常春油麻藤中，各因素對污染率影響的主次水平均為升汞>次氯酸鈉>酒精;而各因素對萌發(fā)數(shù)影響的主次水平因種類的不同而有所不同：對白花油麻藤影響的主次水平為升汞>次氯酸鈉>酒精，對大果油麻藤影響的主次水平為升汞>酒精>次氯酸鈉，對常春油麻藤影響的主次水平為酒精>次氯酸鈉>升汞。由此表明，除常春油麻藤的萌發(fā)數(shù)外，升汞對4種油麻藤的污染率以及3種油麻藤的萌發(fā)數(shù)均起主導(dǎo)作用。由表7的數(shù)據(jù)可得，4種油麻藤低污染率的最優(yōu)組合分別是，美葉油麻藤為A3B2C3，白花油麻藤為A3B3C3，大果油麻藤和常春油麻藤的均為A2B3C2;4種油麻藤萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合分別是：美葉油麻藤和常春油麻藤均為A3B2C2，白花油麻藤、大果油麻藤均為A3B2C3。由此表明，美葉油麻藤滅菌的最優(yōu)處理為酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10～15 min。白花油麻藤滅菌的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10～15 min，再用升汞15 min。大果油麻藤低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞15 min。常春油麻藤低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10 min。

3?討論與結(jié)論

消毒是組培快繁的一個重要環(huán)節(jié)，成功與否直接決定著組培快繁的成功。消毒一方面要把表面微生物殺死，另一方面還要減少消毒劑對其組織和表面細(xì)胞的傷害，這樣才能獲得不污染且存活率較高的外植體。單一使用一種消毒劑污染率極高，例如試驗中4種油麻藤種子單獨采用75%酒精消毒的污染率均較高。因此，油麻藤種子消毒以幾種消毒劑組合為宜。本試驗對4種油麻藤采用了酒精、次氯酸鈉和升汞3種消毒劑進(jìn)行不同浸泡時間的消毒試驗。結(jié)果表明：酒精和次氯酸鈉對4種油麻藤的污染率、萌發(fā)數(shù)的影響不大;而升汞對4種油麻藤的污染率的影響較大，對種子萌發(fā)數(shù)的影響，除對常春油麻藤的影響不大外，對其余3種的萌發(fā)數(shù)均有顯著影響。4種油麻藤的萌發(fā)數(shù)最優(yōu)組合有所差異，產(chǎn)生這種差異的原因一方面可能是由物種自身特性決定的，也可能與消毒劑類型有關(guān)。酒精、次氯酸鈉、升汞的消毒原理有所不同：75%酒精通過在細(xì)菌表面蛋白未變性前向菌體內(nèi)部滲入從而使細(xì)菌蛋白脫水、變性凝固，最終殺死細(xì)菌;次氯酸鈉通過水解形成次氯酸后又分解成新生態(tài)氧，新生態(tài)氧將菌體和病毒上的蛋白質(zhì)氧化后變性從而殺死病原微生物;Hg2+通過與細(xì)菌細(xì)胞中的酶或蛋白質(zhì)上的-SH 基結(jié)合而使之失活或變性從而殺死細(xì)菌，但升汞對真菌的芽孢消毒無效[18]。由于每種消毒劑的消毒原理有所差異，因此，消毒對物種的影響也不同，消毒效果以及最優(yōu)組合也不同。

在本研究中，油麻藤種子萌發(fā)率極低，原因可能有兩個。一是與種子的成熟度有關(guān)，另一個與種皮堅硬有關(guān)。油麻藤分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，在6月會出現(xiàn)營養(yǎng)和生殖共同生長的現(xiàn)象[19-21]，植物各部位為了爭奪營養(yǎng)會提升自身部位的競爭力，芽和果實都具有很高的生活力，但此時的種子成熟度較低，胚未完全發(fā)育形成，不利于萌發(fā)。10月后果實已完全成熟，因為缺少競爭，種子生活力低于6月的，因此萌發(fā)率低，有的甚至長時間不發(fā)芽[13]。據(jù)研究報道，常春油麻藤種子不經(jīng)任何處理的發(fā)芽率為28.3%，但若將種皮磨破后，發(fā)芽率明顯高于種皮完好的種子發(fā)芽率，可達(dá)71.7%[11]。還有研究表明，萌發(fā)前，通過磨破種皮，可有效提高油麻藤種子的萌發(fā)效果[22]。因此，提高油麻藤種子的萌發(fā)率，應(yīng)選擇成熟度60%的種子進(jìn)行消毒，經(jīng)過破殼處理后再接種。

本研究結(jié)果表明，3種不同消毒劑對種子的滅菌效果影響有所不同。酒精和次氯酸鈉對4種不同油麻藤屬植物的污染率、萌發(fā)數(shù)無顯著影響;升汞對污染率的影響顯著，對萌發(fā)數(shù)的影響，除了常春油麻藤無顯著影響，其余3種均有顯著影響。各種油麻藤的消毒滅菌最優(yōu)組合均不同：美葉油麻藤滅菌的最優(yōu)處理為酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10～15 min;白花油麻藤滅菌的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10～15 min，再用升汞15 min;大果油麻藤低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞15 min;常春油麻藤低污染率的最優(yōu)組合是酒精40 s后次氯酸鈉15 min，再用升汞10 min，高萌發(fā)數(shù)的最優(yōu)組合是酒精60 s后次氯酸鈉10 min，再用升汞10 min。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）