彭澎，劉蘭蘭，汪啟明，饒力群

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

隨著全球氣溫的上升，熱逆境對植物的影響日趨顯著[1–2]。水稻在孕穗期和抽穗期對溫度極為敏感[3]。水稻劍葉的膜透性與溫度相關(guān)，它影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響水稻生長[4]。植物類囊體膜的通透性與植物耐熱存在密切聯(lián)系，類囊體二半乳糖甘油酯合成酶(DGD)基因?qū)δねㄍ感云鹫{(diào)控作用。在擬南芥和其他一些高等植物中，DGD 基因通過調(diào)控類囊體單半乳糖甘油酯和雙半乳糖甘油酯的比例調(diào)控?cái)M南芥耐熱能力，從生理水平提高植物的耐熱性[5]。關(guān)于DGD 基因功能研究的研究對象多集中于擬南芥[6–8]，而對于其在水稻中表達(dá)的研究較少。利用基因芯片分析植物逆境脅迫下的表達(dá)情況，可以發(fā)掘與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因，探究逆境脅迫下的分子機(jī)制，為植物抗逆提供理論基礎(chǔ)[9]。筆者通過多種水稻生物信息學(xué)網(wǎng)站，分析水稻DGD基因的基因序列及其響應(yīng)熱和干旱脅迫的表達(dá)特征；利用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，分析OsDGD 在不同時(shí)間熱脅迫日本晴、9311 和N22 中的表達(dá)水平，旨在進(jìn)一步明確OsDGD 參與水稻耐熱信號傳導(dǎo)的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為日本晴(Oryza sativa L. spp. japonica cv. Nipponbare)、9311(Oryza sativa L. spp. indica cv. 9311)、N22(Oryza sativa L. spp. Aus cv. Nagina 22)水稻品種。

1.2 方法

1.2.1 水稻DGD 基因的生物信息學(xué)分析

水稻DGD 基因的結(jié)構(gòu)特征和上游調(diào)控元件分別由Rice–map(http://www.ricemap.org/ index.jsp)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtool s/plantcare/html/)進(jìn)行分析；分別進(jìn)行蛋白同源性及相互作用分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。利用STRING(http://www.string–db.org/)分析蛋白同源性及其相互作用；運(yùn)用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ROAD(http://ricearray.org/index.shtml)進(jìn)行水稻DGD 基因的生物芯片分析，其中干旱脅迫處理水稻分蘗期葉片的相對含水量為65% ～75%，熱脅迫處理材料為生長14 d 的水稻幼苗，于42℃培養(yǎng)3 h。

1.2.2 水稻DGD 基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量分析

取幼穗分化至6 ～7 期的水稻材料，置于光照16 h、相對濕度80%、42℃的恒溫培養(yǎng)室，分別取處理0、3、6、12 h 的水稻劍葉進(jìn)行液氮速凍，于－80℃保存，以處理0 h 的植株為對照。利用Trizol法分別提取以上材料的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，均一化濃度后作為反應(yīng)模板。根據(jù)OsDGD 的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物，以水稻ACTIN 作為內(nèi)參基因(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)步驟參照熒光定量PCR 試劑盒(康為世紀(jì)公司)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。相對表達(dá)水平用2–ΔΔCt法[10]計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物 Table 1 Primers for RT–qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻DGD 基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 水稻DGD 基因的序列分析結(jié)果

比對擬南芥DGD 序列，發(fā)現(xiàn)水稻DGD2 基因(LOC_Os11g05990)位于11 號染色體，長度為4 773 bp，其蛋白質(zhì)含737個(gè)氨基酸殘基。進(jìn)一步在水稻基因組中比對水稻DGD2 基因，發(fā)現(xiàn)水稻中還存在另外4個(gè)與OsDGD2(LOC_Os11g05990)同源性較高的基因 OsDGD1(LOC_Os03g11560.1)、OsDGD3 (LOC_Os02g33580.1)、OsDGD4(LOC_Os 03g16140.1)和OsDGD5(LOC_Os04g34000.1)，它們都具有二半乳糖甘油脂合成酶功能。分析OsDGD 啟動子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因均具有光應(yīng)答順式作用元件G–box，且OsDGD3 和OsDGD4 具有熱脅迫應(yīng)答順式作用元件HSE，OsDGD2、OsDGD3、OsDGD4和OsDGD5都具有脫落酸應(yīng)答順式作用元件ABRE。

2.1.2 水稻DGD 的同源比對與進(jìn)化分析

通過STRING 對5個(gè)OsDGD 的蛋白序列進(jìn)行同源比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。由圖1 可知，DGD 存在于多個(gè)物種中，在高粱、短柄草、擬南芥、葡萄和毛果楊的相似度較高，表明DGD 基因在多種物種中保守存在。

圖1 OsDGD同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.1 Phylogenetic tree of OsDGDgenes and their homologous proteins

2.1.3 水稻DGD 基因的生物芯片分析

水稻對干旱的響應(yīng)能力分析結(jié)果表明，在葉、根、穗等部位，OsDGD2、OsDGD3、OsDGD4 和OsDGD5 基因在干旱脅迫處理后的表達(dá)水平比正常生長的均高，而OsDGD1 的表達(dá)水平比正常生長的低(圖2–A)。通過對水稻熱脅迫響應(yīng)能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)OsDGD 基因的表達(dá)水平均比正常生長的低(圖2–B)。通過對OsDGD 在不同水稻品種中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在日本晴和9311 中，OsDGD1、OsDGD2 和OsDGD5 基因的表達(dá)量均不高，而OsDGD3 和OsDGD4 的表達(dá)量較高(圖3–A)。在N22中，OsDGD2、OsDGD3 和OsDGD4 的表達(dá)量較高，而OsDGD1 和OsDGD5 的表達(dá)量較低(圖3–B)。

圖2 OsDGD基因在干旱和熱脅迫下的芯片表達(dá)分析結(jié)果 Fig.2 Chip expression analysis of OsDGDgenes in drought and thermal stresses

圖3 OsDGD基因在不同材料中的芯片表達(dá)分析結(jié)果 Fig.3 Chip expression analysis for OsDGDgenes at different materials

2.2 水稻DGD 基因響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)定量PCR 方法研究OsDGD 在熱脅迫時(shí)的表達(dá)水平，結(jié)果表明，不同水稻品種中，OsDGD響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)呈現(xiàn)較大的差異。在熱脅迫時(shí)，OsDGD1 在日本晴及9311 中的表達(dá)量下降，在N22中的表達(dá)量升高。OsDGD1 在9311 中的表達(dá)量隨著熱處理時(shí)間的增加而逐漸降低；在日本晴及N22中，隨著熱處理時(shí)間的增加，其表達(dá)量也逐漸增加(圖4)。OsDGD2 在日本晴中的表達(dá)為先下降后升高，隨著熱處理時(shí)間的增加，其表達(dá)量逐漸升高；在9311 中，OsDGD2 的表達(dá)量下降，且3 h 處理后的表達(dá)量基本不變；在N22 中，OsDGD2 在高溫脅迫下被顯著誘導(dǎo)，其表達(dá)量明顯提高(圖 5)。OsDGD3 基因在日本晴及9311 中，其表達(dá)是先下降后升高，而在N22 中表達(dá)明顯提高，且隨著高溫脅迫時(shí)間的增加，其表達(dá)量均逐漸增加(圖6)。OsDGD4 與OsDGD3 呈現(xiàn)出類似的表達(dá)情況，但其總體表達(dá)量均比OsDGD3 的高(圖7)。隨著高溫脅迫時(shí)間的增加，OsDGD5 在日本晴中的表達(dá)量逐漸增加；隨著熱處理時(shí)間增加，OsDGD5 在9311 及N22 中的表達(dá)量有所下降(圖8)。上述研究結(jié)果表明，隨高溫處理時(shí)間的增加，在耐熱水稻中，OsDGD1、OsDGD2、OsDGD3 和OsDGD4 的表達(dá)量增加，而在不耐熱水稻中的表達(dá)量減少，表明OsDGD1、OsDGD2、OsDGD3 和OsDGD4 參與了水稻的熱脅迫反應(yīng)。

圖4 OsDGD1 在不同熱脅迫處理水稻中的相對表達(dá)量 Fig.4 Expression analysis for OsDGD1 at different thermal stresses and different rice varieties

圖5 OsDGD2 在不同熱脅迫處理水稻中的相對表達(dá)量 Fig.5 Expression analysis for OsDGD2 at different thermal stresses and different rice varieties

圖6 OsDGD3 在不同熱脅迫處理水稻中的相對表達(dá)量 Fig.6 Expression analysis for OsDGD3 at different thermal stresses and different rice varieties

圖7 OsDGD4 在不同熱脅迫處理水稻中的相對表達(dá)量 Fig.7 Expression analysis for OsDGD4 at different thermal stresses and different rice varieties

圖8 OsDGD5 在不同熱脅迫處理水稻中的相對表達(dá)量 Fig.8 Expression analysis for OsDGD5 at different thermal stresses and different rice varieties

3 結(jié)論與討論

擬南芥DGD1 突變體的DGDG 含量較野生型的低，導(dǎo)致該突變體的光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能以及對熱脅迫的響應(yīng)等方面均發(fā)生了一定變化[11–12]。本研究中通過生物信息學(xué)網(wǎng)站STRING，分析了可能與OsDGD 蛋白相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)粳稻中參與合成光合膜主要結(jié)構(gòu)成分的單半乳糖甘油酯合成酶與OsDGD 的相互作用最強(qiáng)，表明DGD 與葉綠體中類囊體膜的透性相關(guān)。對OsDGD 啟動子順式作用元件的分析結(jié)果表明，5個(gè)基因分別具有與光應(yīng)答和非生物脅迫相關(guān)的作用元件。熱脅迫應(yīng)答順式作用元件HSE，OsDGD2、OsDGD3、OsDGD4 和OsDGD5 具有脫落酸應(yīng)答順式作用元件ABRE。由此推測，OsDGD 可能參與調(diào)控光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和響應(yīng)耐熱等非生物脅迫的信號傳導(dǎo)。

水稻耐熱品種N22 受熱脅迫時(shí)表現(xiàn)出相對較好的花藥開裂水平和較高的結(jié)實(shí)率，體現(xiàn)了其本質(zhì)的耐熱性[13]。Li 等[14]和Deepti 等[15]發(fā)現(xiàn)水稻N22品種響應(yīng)干旱脅迫與熱脅迫的信號途徑中存在多個(gè)調(diào)控元件。本研究中通過干旱脅迫和熱脅迫的水稻芯片分析，發(fā)現(xiàn)OsDGD 表達(dá)受耐熱和干旱脅迫調(diào)控，且在N22 中多個(gè)OsDGD 對干旱脅迫更敏感。通過實(shí)時(shí)定量PCR 分析，發(fā)現(xiàn)在分化至6 ～7 期的水稻幼穗劍葉中，5個(gè)OsDGD 同源基因在日本晴、9311 和耐熱品種N22 中的表達(dá)有差異，OsDGD3和OsDGD4 的表達(dá)量均高，OsDGD1 和OsDGD5的表達(dá)量均低，而OsDGD2 在日本晴及9311 中的表達(dá)量較低，在N22 中的表達(dá)量高。隨高溫處理時(shí)間的增加，在日本晴中，5個(gè)OsDGD 基因的表達(dá)量無明顯變化；在9311 中，5個(gè)OsDGD 基因的表達(dá)量均下降，而在耐熱水稻品種N22中，除OsDGD5外，其余4個(gè)基因的表達(dá)量較其他2 種水稻材料的高， OsDGD1、OsDGD2 和OsDGD3 在N22 中的表達(dá)明顯受到熱脅迫的誘導(dǎo)。試驗(yàn)結(jié)果與生物芯片分析結(jié)果基本相吻合，進(jìn)一步表明OsDGD 參與了對水稻耐熱性的調(diào)控。

綜合分析，認(rèn)為OsDGD 與水稻耐熱具有相關(guān)性，是一個(gè)潛在的水稻耐熱調(diào)控元件。水稻的耐熱表型與多種環(huán)境因子密切相關(guān)，植物響應(yīng)光、溫信號基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子遺傳機(jī)制至今仍不清楚，因此，挖掘新的水稻耐熱分子傳導(dǎo)途徑對全面認(rèn)識植物耐熱分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。

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