于正強(qiáng)，陳瑾，2，彭西*，方靜，陳科杰，何楊

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.西昌市畜牧局，四川 西昌 615000 )

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)主要為黃曲霉菌及寄生曲霉菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1–2]。AFs 對(duì)糧農(nóng)產(chǎn)品的污染是全球面臨的嚴(yán)重問(wèn)題[3]。黃曲霉毒素B1(AFB1)急性中毒可引起動(dòng)物急性肝損傷，嚴(yán)重者甚至死亡。有研究表明，攝食高含量的AFB1是造成肝癌的重要原因[4]。同時(shí)，攝食含AFB1的食物，可下調(diào)機(jī)體內(nèi)多種免疫因子水平，進(jìn)而降低其免疫功能[5]。AFs 對(duì)哺乳動(dòng)物的免疫毒性主要表現(xiàn)為T(mén) 淋巴細(xì)胞增殖受阻、多種細(xì)胞因子水平下調(diào)[5]。外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映體內(nèi)成熟T 淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能的重要指標(biāo)。目前，AFB1對(duì)雛雞外周血T 淋巴細(xì)胞亞群、IL–2 和IFN–γ 的影響的報(bào)道甚少。本試驗(yàn)以1日齡艾維茵肉雞為研究對(duì)象，探究梯度劑量的AFB1日糧對(duì)雛雞外周血T 淋巴細(xì)胞亞群、IL–2 和IFN–γ 的影響，旨在為進(jìn)一步探討AFB1致免疫功能損傷的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試動(dòng)物與日糧

試驗(yàn)選用1日齡艾維茵健康公雛雞100 只，按初始體重?zé)o差異原則隨機(jī)分為4組，每組25 只，分別采食基礎(chǔ)日糧和AFB1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組日糧。飼養(yǎng)管理與常規(guī)育雛一致，自由飲水與采食，試驗(yàn)期21 d。

AFB1日糧的配制方法為：分別將1.5、3、6mg AFB1粉末溶于30mL 甲醇中，再將30mL 溶液逐級(jí)摻入10 kg 基礎(chǔ)日糧中，然后將摻有甲醇的日糧置于37℃烘箱中烘干，待甲醇揮發(fā)后取出。對(duì)照組日糧取30mL 甲醇混入10 kg 基礎(chǔ)日糧后，以同樣方法烘干。由此方法配制而成的對(duì)照組、AFB1Ⅰ、Ⅱ組、Ⅲ組日糧中，AFB1的含量分別為0、0.15、0.3、0.6mg/kg。

基礎(chǔ)日糧以玉米–豆粕為主配制而成，其中蛋白質(zhì)含量、能量以及維生素和微量元素添加量均參照肉雞NRC(2004)的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)?；A(chǔ)日糧配方見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平 Table 1 Composition of the experimental diets and nutrition level

1.2 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

試驗(yàn)第7、14 和21天，每組隨機(jī)取5 只雛雞，頸靜脈抽取1mL 外周血，EDTA 二鈉抗凝。取1mL淋巴細(xì)胞分離液于流式管中，將血液沿管壁徐徐加至淋巴細(xì)胞分離液之上，保持清晰的分層狀態(tài)，隨后2 000 r/min 離心30min。離心后可見(jiàn)試管內(nèi)血液明顯分為3 層，上層為血漿層，中層為分離液層，底層為紅細(xì)胞層，用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞層吸出，收集到另一流式管中，PBS 洗2次后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，吸取100 μL 細(xì)胞懸液于流式管中，加入CD4–FITC(SouthernBiotech, USA)、CD8–PE(SouthernBiotech, USA)和 CD3– SPRD(SouthernBiotech, USA)單克隆抗體，室溫下避光反應(yīng)30min，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)后用Cell Quest 軟件分析 CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的百分比，并計(jì)算CD3+CD4+T 與CD3+CD8+T 細(xì)胞的比值。

1.3 血清IL–2、IFN–γ 含量檢測(cè)

試驗(yàn)第7、14 和21天，每組隨機(jī)取5 只雛雞，頸靜脈采血，3 000 r/min 離心10min，分離血清，4℃保存，備用。用 ELISA 試劑盒檢測(cè) IL–2 (11R020，Rapidbio, USA)、IFN–γ(11R046, Rapidbio, USA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用單因素方差分析法分析試驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群的變化

從表2 可以看出，與對(duì)照組比較，Ⅰ組外周血CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 細(xì)胞亞群所占百分比差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅱ組和Ⅲ組外周血CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 細(xì)胞亞群所占百分比顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05 或P<0.01)，各組間的CD4+/CD8+比值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從流式象限圖(圖1)可以看出，隨著日糧中黃曲霉毒素含量的增加，CD3+CD4+T 細(xì)胞和CD3+CD8+T 細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

表2 外周血T 淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比率的變化 Table 2 Percentage change of the peripheral blood T-lymphocyte subsets and ratio of CD4+/CD8+

圖1 21日齡雛雞的T 淋巴細(xì)胞亞群流式象限圖 Fig.1 The quadrantal diagram of T–lymphocyte subsets detected with flow cytometer method at 21 days of age

2.2 血清IL–2、IFN–γ 含量的變化

血清IL–2 檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，14日齡時(shí)，AFB1Ⅰ組IL–2 含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；7、14 和21日齡時(shí)，Ⅱ組IL–2 含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；7、14 和21日齡時(shí)，Ⅲ組IL–2 含量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05 或P<0.01)。

表3 不同日齡雛雞血清的IL–2 含量 Table 3 Changes of the serum IL–2 content with day of age

血清IFN–γ 檢測(cè)結(jié)果(表4)顯示，7日齡時(shí)，AFB1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組IFN–γ 含量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05 或P<0.01)；14日齡時(shí)血清IFN–γ 含量與對(duì)照組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但仍呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；21日齡時(shí)，AFB1Ⅱ、Ⅲ組IFN–γ含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 不同日齡雛雞血清的IFN–γ 含量 Table 4 Changes of the serum IFN–γ content with day of age

3 結(jié)論與討論

成熟T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要參與者，其生物學(xué)功能由表面的亞群結(jié)構(gòu)決定。CD3 是成熟T 細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD4 和CD8 分別表達(dá)于不同的亞群之上，CD4+T細(xì)胞是輔助性T淋巴細(xì)胞，而CD8+T 細(xì)胞是毒性T 淋巴細(xì)胞，二者均能增強(qiáng)TCR/CD3 復(fù)合物結(jié)合抗原多肽或MHC 復(fù)合物的能力[6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅱ、Ⅲ組(AFB1含量分別為0.3、0.6mg/kg)外周血CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T 細(xì)胞所占百分比均顯著降低，且此效應(yīng)從7日齡持續(xù)到21日齡。Tomková 等[7]和Sabourin 等[8]研究表明，AFB1可明顯降低小鼠外周血CD3+T 細(xì)胞；Heugten 等[9]和Raisuddin 等[10]分別對(duì)豬和小鼠攝食AFB1后免疫功能的研究表明，AFB1可抑制T、B 淋巴細(xì)胞的增殖。胸腺為雛雞中樞免疫器官，是CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞活化和分化的場(chǎng)所，成熟T 細(xì)胞由胸腺轉(zhuǎn)移到外周血和次級(jí)免疫器官[11]，因而T 細(xì)胞亞群的改變可反映機(jī)體胸腺功能的變化。AFB1可抑制淋巴細(xì)胞mRNA 的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)影響DNA、RNA 的作用和蛋白質(zhì)的生物合成[7,9,12]，擾亂細(xì)胞有絲分裂的物質(zhì)準(zhǔn)備。本試驗(yàn)結(jié)果外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比例下降可能是AFB1抑制胸腺淋巴細(xì)胞增殖所致，這可能是引起成熟T 淋巴細(xì)胞減少的原因。此外，CD4+與CD8+的比值也是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)。本試驗(yàn)中AFB1組外周血T 細(xì)胞中CD4+與CD8+的比值與對(duì)照組比較差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是CD3+CD4+和CD3+CD8+T 細(xì)胞的比例同時(shí)下降的結(jié)果。

IL–2 主要是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下，由活化的CD4+Th1 細(xì)胞分泌，是T 淋巴細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期的主要刺激因子[6]。IL–2 能促進(jìn)T 細(xì)胞增殖，通過(guò)增加T 細(xì)胞數(shù)量，提高CD4+T細(xì)胞活性，以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，同時(shí)IL–2 可刺激活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生IL–2[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AFB1Ⅱ、Ⅲ組血清IL–2含量明顯降低，與Dugyala 等[14]用AFB1處理CD–1小鼠，結(jié)果顯示脾細(xì)胞IL–2 表達(dá)量及其mRNA 水平顯著下降的結(jié)果一致。IL–2 表達(dá)量的減少可能是AFB1影響淋巴細(xì)胞內(nèi)DNA 轉(zhuǎn)錄和mRNA 翻譯，最終影響蛋白質(zhì)的生物合成的結(jié)果[14–15]。本試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)到血清IL–2 含量的減少和CD4+T 淋巴細(xì)胞比例降低，這可能與CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，致其分泌的IL–2 減少，抑制了T 淋巴細(xì)胞的增殖有關(guān)[16]。Choi 等[17]用AFB1處理鼠脾臟培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果細(xì)胞中IFN–γ 的表達(dá)量明顯降低，AFB1能抑制IFN–γ 的表達(dá)并呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，本研究結(jié)果與其一致。IFN–γ 是由活化的CD4+Th1 細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，IFN–γ 的表達(dá)可促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞的功能[18]，因而IFN–γ 的減少可能是由CD4+T淋巴細(xì)胞比例降低所致，同時(shí)IFN–γ 含量減少又會(huì)影響CD8+T 細(xì)胞的正常分化和增殖。在14日齡時(shí)，IFN–γ 水平與對(duì)照組相比呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與不同個(gè)體對(duì)黃曲霉毒素的敏感性不同有關(guān)，也可能與機(jī)體通過(guò)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)使各項(xiàng)機(jī)能接近正常有關(guān)[19]。

綜上所述，雛雞攝食含AFB1的日糧，可降低外周血T 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及血清IL–2 和IFN–γ含量，進(jìn)而導(dǎo)致其細(xì)胞免疫功能受損。

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