朱曉蘭，劉百戰(zhàn)，王維妙，高蕓

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，安徽 合肥230052；2.上海煙草集團有限責(zé)任公司煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室，上海200082)

果膠是植物細(xì)胞壁所特有的組分，屬于多糖類碳?xì)浠衔颷1]。過多的果膠質(zhì)影響煙葉的彈性和韌性[2]，造成干煙葉糙碎。果膠因親水力強，易使煙葉過度吸濕，造成煙葉的工業(yè)可用性和貯藏的安全性降低。果膠發(fā)酵生成多達1% ～1.5%的乙酸，乙酸有辛辣和刺激味[3]。果膠質(zhì)在燃吸過程中產(chǎn)生甲醇，甲醇再進一步氧化為甲醛、甲酸，不僅使煙氣具有刺激性，而且不利于吸煙的安全性；較高的果膠質(zhì)含量還會導(dǎo)致卷煙焦油量升高[4]，因此，對于煙草吸味品質(zhì)來說，果膠是一種不利的化學(xué)成分。

有研究表明，在煙草加工過程中，向煙葉中添加一定量的生物酶，能促使部分細(xì)胞壁物質(zhì)降解為水溶性糖，使得煙葉刺激性雜氣有所降低，從而改善煙葉品質(zhì)[5–6]。于建軍等[7]用果膠酶處理煙葉，煙葉果膠質(zhì)含量降低，香氣物質(zhì)總量提高了29.94%。鞏效偉等[8]利用果膠酶處理煙梗后，細(xì)胞壁類物質(zhì)含量降低，還原糖含量升高，中性致香成分總量明顯提高。筆者利用果膠甲酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素復(fù)合酶4 種生物酶處理煙葉，部分細(xì)胞壁物質(zhì)發(fā)生了降解，采用13C NMR 光譜法研究了降解后果膠的含量和結(jié)構(gòu)(甲酯度、乙酰度及中性糖比例)的變化，并結(jié)合煙葉致香成分的分析，試圖從果膠的精細(xì)結(jié)構(gòu)上把握果膠的降解，為提高煙葉品質(zhì)和使用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南清香型煙葉C3F，取自安徽中煙工業(yè)公司，煙樣于40℃烘箱中干燥4 h后，粉碎備用。

果膠甲酯酶(PE)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠裂解酶(PNL)和纖維素復(fù)合酶(CE)，活性為20 000 U/g，購自南京添嘉生物科技有限公司。聚半乳糖醛酸(PGA，99.5%)和四甲基硅烷(98.5%)購自上海百靈威化學(xué)品公司；山梨醇內(nèi)標(biāo)和中性糖標(biāo)樣購自上海試劑二廠。

主要儀器：AVANCE AV 400 spectrometer超導(dǎo)傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀(瑞士布魯克公司)；Trace ISQ 氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司，配DB–5MS毛細(xì)管色譜柱)；同時蒸餾萃取裝置(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)玻璃儀器廠定制)；S7500超聲波發(fā)生器(廣東必能信超聲有限公司)。

1.2 方法

將PE、PG、PNL和CE用50℃的蒸餾水溶解，配制成5、10、20g/L的單酶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

將云南烤煙C3F煙葉回潮后切絲，每份50g。將質(zhì)量濃度為5、10、20g/L的酶溶液50mL，裝入小型噴霧器，均勻噴灑于煙絲上。將煙絲裝入2層用水濕潤過的食品包裝袋中，密封，置于調(diào)溫調(diào)濕箱中(溫度50℃，相對濕度25%)貯存4 h，用于酶解。酶解結(jié)束后，迅速將煙絲放入80℃烘箱中，保持20min，使酶在高溫條件下完全失活。以不加酶的蒸餾水作為對照，每個處理重復(fù)3次。酶解后的煙絲40℃烘干，研磨成粉末，用于測定果膠含量及結(jié)構(gòu)、纖維素、木質(zhì)素、常規(guī)化學(xué)成分和中性致香成分。

煙葉中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量按照YC/T347—2010 的方法測定。果膠的提取、含量及結(jié)構(gòu)的測定按文獻[9]方法進行。

按YC/T159—2002、YC/T160—2002、YC/T161— 2002、YC/T162—2002、YC/T217—2007 測定煙葉中總糖、總植物堿、總氮、氯離子、鉀離子的含量。

按照文獻[10]方法，采用同時蒸餾萃取和GC/MS 測定煙葉中性致香物質(zhì)含量。參照文獻[13]和[11]方法進行果膠中性糖的水解和衍生化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶處理對煙葉細(xì)胞壁類物質(zhì)含量的影響

表1列出了4種酶處理后，煙葉中纖維素和木質(zhì)素含量、果膠含量及結(jié)構(gòu)的變化。與對照相比，酶處理后的煙葉樣品果膠、纖維素和木質(zhì)素含量均降低；隨著酶濃度的增大，煙葉中細(xì)胞壁類物質(zhì)的含量呈下降趨勢，當(dāng)酶質(zhì)量濃度高于10g/L后，下降趨緩。果膠酶處理后，煙葉果膠含量降幅較大，降低率為4.6% ～17.8%，纖維素含量降低了0.87% ～ 6.7%，木質(zhì)素降低了2.1% ～9.5%。纖維素酶處理后，煙葉果膠含量降低了1.5% ～4.1%，纖維素含量降低了3.9% ～12.6%，木質(zhì)素降低了4.9% ～8.6%。纖維素酶是復(fù)合酶，在直接降解纖維素，促進纖維素、半纖維素分解的同時，可促進植物細(xì)胞壁的溶解，酶處理后煙葉細(xì)胞壁受到一定程度的破壞，提高了煙葉中果膠酶和木質(zhì)素酶與細(xì)胞壁物質(zhì)的作用效果[12]。果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理后，煙樣果膠的甲酯度顯著降低；多聚半乳糖醛酸酶處理后，煙葉果膠的甲酯度略有增大；纖維素復(fù)合酶處理后，煙葉果膠結(jié)構(gòu)變化不明顯，這主要與不同酶作用的底物不同[13]有關(guān)。果膠甲酯酶促進果膠酸酯脫酯降解生成果膠酸，果膠裂解酶也能夠降解高度甲酯化的果膠，因而使果膠的甲酯度降低更明顯。多聚半乳糖醛酸酶促進聚半乳糖醛酸降解為單糖或寡糖，使得果膠酯的比例增大，因此酯化度增大。煙葉樣品中果膠的乙酰度本身含量較低，酶處理后也有下降的趨勢。

表1 酶處理后煙葉纖維素和木質(zhì)素含量及果膠的甲酯度和乙酰度 Table 1 Contents of cellulose and lignin and degrees of methylation and acetylation of pectin in tobacco treated with enzymes

2.2 酶處理對煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

從表2 中可以看出，與對照相比，酶處理后，煙葉總糖含量增加，且隨酶濃度的增加而增大。煙堿、鉀離子和氯離子含量也有所提高，總氮與對照持平或略有下降。糖含量的升高與細(xì)胞壁類物質(zhì)的降解有關(guān)，同時還為美拉德反應(yīng)提供了反應(yīng)底物，有利于煙葉的香吃味的形成。糖類物質(zhì)必須和煙堿、總氮協(xié)調(diào)，才能使煙氣豐滿、醇和、吃味甜潤、舒適[14]，從糖堿比、糖氮比和氮堿比來看，酶濃度適中(10g/L)時，處理后的煙葉總糖含量明顯提高，但仍能保持化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性[15]，有利于提高煙葉的使用價值。

表2 酶處理后煙葉的常規(guī)化學(xué)成分含量 Table 2 Contents of routine chemical components in tobacco treated with enzymes

2.3 酶處理對果膠中性糖的影響

果膠有3 種結(jié)構(gòu)，HG、RG–Ⅰ和RG–Ⅱ型，主要由以半乳糖醛酸為基本結(jié)構(gòu)的平滑區(qū)和帶有大量中性糖支鏈的半乳糖醛酸和鼠李糖交替連接的毛發(fā)區(qū)組成[16]，在沒有酶催化的情況下，果膠的中性糖支鏈和一些聚合物的糖苷聯(lián)接在提取過程中有輕微的水解，糖醛酸之間和糖醛酸與鼠李糖之間的聯(lián)接是最穩(wěn)定的[17]。表3 結(jié)果顯示，經(jīng)酶處理后，果膠的中性糖的含量均比對照高。果膠甲酯酶處理的中性糖增加最多，其次是多聚半乳糖醛酸酶處理，纖維素復(fù)合酶處理也使果膠中性糖含量(尤其是葡萄糖)增加。

表3 酶處理后煙葉的果膠中性糖含量 Table 3 Neutral sugar contents in pectin from tobacco treated with enzymes μg/g

圖1為不同酶處理后煙葉果膠樣品的中性糖比例。與對照相比，3種果膠酶處理，阿拉伯糖和半乳糖比例明顯增加，尤其是果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理后樣品。因為果膠酶的底物分子是聚半乳糖醛酸和果膠酯，更多的是促進主鏈斷鏈， RG–Ⅰ型結(jié)構(gòu)會相對增大[16]，因此，阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖比例會增大。而纖維素酶不具備專一的底物催化效應(yīng)，雖然也使細(xì)胞壁類物質(zhì)含量下降，但不能對果膠中性糖比例產(chǎn)生類似效果，反而會使葡萄糖比例增大。

圖1 不同酶處理煙草中酸提取果膠中性糖的比例 Fig.1 Ratios of neutral sugars in acid extracted pectin from tobacco treated with enzymes

2.4 酶處理對中性致香物質(zhì)含量的影響

2.4.1 對苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的影響

從表4可以看出，與對照相比，經(jīng)過酶處理的煙葉的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均有不同程度的提高，以質(zhì)量濃度為20g/L的果膠裂解酶處理增加幅度最大，為56.0%，苯甲醇和苯乙醛的含量分別增加了60.4%和64.1%。

表4 酶處理后煙葉苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的含量 Table 4 Contents of phenylalanine degradation products in tobacco treated with enzymes μg/g

表4 (續(xù)) μg/g

2.4.2 對棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量的影響

由表5看出，經(jīng)過酶處理的煙葉，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物(主要是糠醛和糠醇)均有明顯提高，其中以纖維素復(fù)合酶和多聚半乳糖醛酸酶處理增幅較大，在酶質(zhì)量濃度為20g/L時增幅分別為43.3%和35.6%，果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理樣品的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物糠醛增幅較小。

表5 酶處理后煙葉棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的含量 Table 5 Content of maillard reaction products in tobacco treated with enzymes μg/g

2.4.3 對類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量的影響

從表6看出，酶處理后，大部分類胡蘿卜素降解產(chǎn)物比對照有所提高，尤其是β–大馬酮、β–二氫大馬酮和香葉基丙酮含量提高較多。多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理，煙葉的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總含量與對照相近，而果膠裂解酶和纖維素復(fù)合酶處理的樣品明顯增加，在酶質(zhì)量濃度為20g/L時，增幅分別為21.4%和16.9%。

表6 酶處理后煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量 Table 6 Content of carotenoid degradation products in tobacco treated with enzymes μg/g

2.4.4 對新植二烯含量和中性致香物質(zhì)總量的影響

結(jié)果顯示，多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理的樣品的新植二烯含量分別為84.79和87.53μg/g與對照(90.93μg/g)相比略有降低，果膠裂解酶處理樣品的新植二烯含量(96.56μg/g)略有增加，纖維素復(fù)合酶處理樣品的新植二烯含量與對照相比有較大增加，在酶質(zhì)量濃度為20g/L時增幅為56.4%，說明纖維素酶處理比果膠酶處理更能增加煙葉的新植二烯含量。

對中性致香物質(zhì)總量(不含新植二烯)的分析表明，與對照(87.57μg/g)相比，多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理樣含量(分別為94.89和89.99μg/g)略有增加，而果膠裂解酶和纖維素復(fù)合酶處理煙葉含量比對照有較大幅度提高，在酶濃度為20g/L時增幅分別為24.4%和21.9%。

3 結(jié)論

采用13C NMR光譜法研究4種酶制劑降解煙葉后果膠含量及結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明：添加果膠酶或纖維素酶都可以有效降解煙葉中的果膠、纖維素和木質(zhì)素。不同種類酶對果膠的結(jié)構(gòu)變化的影響有所不同，果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理樣品均使果膠的甲酯度降低，多聚半乳糖醛酸酶處理后，果膠的甲酯度略有增大，纖維素復(fù)合酶處理變化不明顯。酶處理后果膠中性糖的含量均比對照樣有所增加，其中果膠甲酯酶處理增加最大，但不同種類酶處理的中性糖比例有區(qū)別，果膠酶處理后阿拉伯糖和半乳糖比例明顯增加，而纖維素酶處理后葡萄糖比例增加較多。

對中性致香物質(zhì)的分析表明，所有酶處理均使苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量呈增加趨勢，但類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和新植二烯含量經(jīng)多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理略有降低或持平，而果膠裂解酶和纖維素酶處理后則呈增加趨勢，其中性香氣物質(zhì)總量(不含新植二烯)分別提高了24.4%和21.9%。據(jù)任曉紅等[2]報道，煙葉中果膠的含量與中性香氣物質(zhì)和一些香氣前體物質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，本試驗中酶處理使煙葉果膠含量下降，中性致香物質(zhì)的總含量增加，與任曉紅等的研究結(jié)論相一致。

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