占今舜，楊宏波，詹康，劉紅，劉明美，趙國琦

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

豆科牧草紫花苜蓿在世界上廣泛分布，且享有盛譽(yù)，被稱為“牧草之王”。紫花苜蓿含有蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是較好的飼料原料之一[1–2]。在西方，小黑麥草是主要的飼草之一；在中國，隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，小黑麥草也被作為飼料作物進(jìn)行開發(fā)。飼用小黑麥草具有相對較強(qiáng)的抗逆性，能夠于干旱瘠薄地、閑散廢棄地生長，對畜牧業(yè)的發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用[3]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體，介導(dǎo)葡萄糖在細(xì)胞膜兩側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛分布于體內(nèi)各種組織。GLUT1 是一種易化擴(kuò)散的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分布廣泛，具有維持基礎(chǔ)狀態(tài)下組織細(xì)胞葡萄糖攝入的功能。GLUT1 是反芻動物乳腺中主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4–6]。細(xì)胞膜脂質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)部多種信號分子等均由脂肪酸構(gòu)成，而脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)是促進(jìn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白之一。FATP4 是動物腸道中唯一存在的FATPs家族成員，存在于腸絨毛細(xì)胞，被認(rèn)為是調(diào)控腸道細(xì)胞吸收脂肪酸的重要因子[7–8]。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT) 在腸道內(nèi)參與二肽和三肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。組織和細(xì)胞中的PepT1 通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)肽類物質(zhì)，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有重要作用[9–10]。

飼料營養(yǎng)水平對葡萄糖、脂肪和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有調(diào)控作用。筆者將質(zhì)量比3∶1 的苜蓿和小黑麥草制成不同精粗比的顆粒全價飼料，研究其對犢牛不同組織GLUT1、FATP4、PepT1 基因的影響，以從分子水平探明不同營養(yǎng)水平對動物營養(yǎng)物質(zhì)吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)日糧和犢牛

根據(jù)NRC(2001)營養(yǎng)需要，采用20 型顆粒飼料機(jī)組，將質(zhì)量比3∶1 的苜蓿和小黑麥草分別制成精粗比75∶25、70∶30、65∶35 和60∶40 的顆粒全價飼料。

將日齡(104.00±1.50) d、平均體重(121.25± 4.12) kg 的中國荷斯坦斷奶公犢牛12 頭分為4組，分別飼喂精粗比75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的顆粒全價飼料(分別稱其為試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組)，預(yù)試期14 d，正試期 56 d。每天飼喂3次，飼喂時間為8:30、14:30 和20:30，每周調(diào)整1次飼喂量，但保證每組犢牛的干物質(zhì)采食量基本一致。犢牛自由飲水，每天有6～7 h戶外活動。每日清晨打掃圈舍，每周至少對牛舍消毒2次。各試驗(yàn)組飼糧的組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

1.2 方法

試驗(yàn)于2014年3月至2014年5月在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場進(jìn)行。

1.2.1 樣品采集

于試驗(yàn)第70天，每組犢牛禁食12 h 后進(jìn)行屠宰，沿縱向剖開腹腔，分離出肝臟、瘤胃、十二指腸和肌肉。用高溫滅菌后的鑷子和手術(shù)剪刀剪取各組織，在滅菌生理鹽水中清洗，裝入1.5mL 的離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移到–80℃的冰箱冷凍保存。

1.2.2 組織總RNA 的提取和cDNA 的合成

根據(jù)RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書進(jìn)行組織總RNA 的提取，采用One Drop 儀測定總RNA 的濃度和純度。根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷RNA 是否有降解。采用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。試驗(yàn)在冰上進(jìn)行。反應(yīng)體系10 μL。反應(yīng)條件：37℃反轉(zhuǎn)入反應(yīng)15min，85℃反轉(zhuǎn)入酶失活反應(yīng)5 s；4℃保存。所得cDNA 保存于–20℃。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank 中的GAPDH、GLUT1、FATP4、PepT1 基因的序列，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)。引物(表2)由Invitrogen 公司合成。

表 2 設(shè)計(jì)引物 Table 2 Primer design

1.2.4 Real Time–PCR 反應(yīng)條件

根據(jù)TaKaRa 試劑盒說明書配制反應(yīng)液(表3)。在羅氏Light Cycler? 96 PCR 儀上進(jìn)行檢測。條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)；65℃延伸15 s。RT–PCR 反應(yīng)液總體積20 μL，其中， SYBR 預(yù)混合試劑Ex TaqⅡ(2×)10 μL(終濃度1×)；10 μmol/L PCR 正向引物0.8 μL(終濃度0.4 μmol/L)，10 μmol/L PCR 反向引物0.8 μL(終濃度0.4 μmol/L)，cDNA 模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

先用Excle 2007 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，根據(jù)公式2–△Ct計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量，其中△Ct＝Ct目的基因－Ct管家基因。采用SPSS 17.0 進(jìn)行單因素方差分析，用LSD 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 各試驗(yàn)組犢牛不同組織中GLUT1 mRNA 的相對表達(dá)量

從表3 中可以看出，試驗(yàn)Ⅲ組犢牛肝臟、瘤胃、十二指腸和盲腸的GLUT1 mRNA 相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)Ⅳ，試驗(yàn)I組皺胃的GLUT1 mRNA 相對表達(dá)量極顯著高于試驗(yàn)Ⅲ和Ⅳ組。

表3 不同組織中GLUT1 mRNA 的相對表達(dá)量 Table 3 Relative expression levels of GLUT1 mRNA in different tissues

2.2 各試驗(yàn)組犢牛不同組織中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量

由表4 可見，試驗(yàn)Ⅲ組犢牛肝臟中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量極顯著高于試驗(yàn)Ⅳ組，顯著高于試驗(yàn)I 和Ⅱ組；試驗(yàn)I組瘤胃和十二指腸中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)Ⅲ組；試驗(yàn)I組皺胃中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量極顯著高于試驗(yàn)Ⅳ組；試驗(yàn)Ⅲ組盲腸中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于其他各組。

表4 不同組織中FATP4 mRNA 的相對表達(dá)量 Table 4 Relative expression levels of FATP4 mRNA in different tissues

2.3 各試驗(yàn)組犢牛不同組織中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量

從表5 中可以看出，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅳ組犢牛肝臟中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)Ⅰ和Ⅲ組，試驗(yàn)I 和Ⅳ組瘤胃中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組，試驗(yàn)I組皺胃和十二指腸中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)Ⅳ組，試驗(yàn)Ⅲ組盲腸中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)I 和Ⅳ組。

表5 不同犢牛組織中PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量 Table 5 Relative expression levels of PepT1 mRNA in different tissues

3 結(jié)論與討論

不同精粗比飼糧顯著或極顯著地影響著綿羊瘤胃纖維素酶的活性[11]。采食精粗比20∶80、30∶70、和40∶60 的日糧，小尾寒羊纖維素和半纖維素消化量呈先上升后下降的趨勢[12]，說明適當(dāng)?shù)木直热占Z可以促進(jìn)纖維素的分解，進(jìn)而提高葡萄糖的生成。潘巧等[13]發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧，奶山羊門靜脈吸收丙酸的量增加，導(dǎo)致肝臟增強(qiáng)吸收和利用丙酸，使肝臟糖異生相關(guān)酶基因的表達(dá)上調(diào)。當(dāng)細(xì)胞外葡萄糖濃度增加時，細(xì)胞膜上GLUT1 的表達(dá)增加[14–15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，除皺胃外，試驗(yàn)Ⅲ組各組織中GLUT1 mRNA 的相對表達(dá)量最高，說明精粗比為65∶35 的日糧更利于犢牛吸收葡萄糖。試驗(yàn)Ⅳ組皺胃的GLUT1 mRNA 相對表達(dá)量低于其他各組，可能是因?yàn)楦呔先占Z中淀粉的含量高，瘤胃淀粉分解菌占優(yōu)勢，淀粉被大量降解，未被瘤胃降解的部分淀粉則在皺胃中被消化酶分解成葡萄糖，導(dǎo)致GLUT1 基因表達(dá)升高，促進(jìn)葡萄糖的吸收。

給COS1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染FATP4 cDNA 導(dǎo)致棕櫚酰– CoA 合成酶和二十四烷基–CoA 合成酶升高[16]，表明FATP4 基因能夠編碼酰–CoA合成酶，說明FATP4在長鏈脂肪酸的攝取和代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。長鏈脂肪酸的合成原料是乙酰輔酶A，而反芻動物脂肪酸的合成是由瘤胃中形成的乙酸和丁酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 和丁酰輔酶A 的。隨精料水平的增加，瘤胃乙酸、丁酸含量降低，丙酸含量增加[17]；隨采食時間的延長，揮發(fā)性脂肪酸含量呈先增加后降低趨勢。隨精粗比的升高，奶牛瘤胃的乙酸、丁酸含量降低[18]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅲ組肝臟FATP4基因的表達(dá)高于其他各組，可能是因?yàn)樵摻M日糧使瘤胃產(chǎn)生的乙酸、丁酸含量高，導(dǎo)致肝臟合成脂肪酸多，促進(jìn)肝臟對脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。飼料中的脂肪在瘤胃微生物作用下水解產(chǎn)生甘油和各種脂肪酸。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)I組瘤胃、皺胃和十二指腸FATP4 基因的表達(dá)量最高，這可能是因?yàn)樵摻M日糧中含量較高的蛋白和脂肪在瘤胃微生物的作用下大量合成脂肪酸。

在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)I組的日糧蛋白質(zhì)水平最高，因此，在瘤胃降解成的小肽較多，進(jìn)而導(dǎo)致瘤胃、皺胃和十二指腸的PepT1 mRNA 相對表達(dá)量最高。盲腸是反芻動物微生物消化的另一主要場所。王東升[19]等發(fā)現(xiàn)，高精粗比能顯著提高山羊盲腸內(nèi)容物和盲腸靜脈的生物胺含量。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)I組PepT1 基因的表達(dá)量最低，可能是由盲腸中產(chǎn)生的大量生物胺導(dǎo)致小肽生成較少引起。張樹坤等[20]發(fā)現(xiàn)，高精料飼喂泌乳期山羊，其肝臟中氨基酸消耗增多，同時小肽合成減少。本試驗(yàn)中試驗(yàn)I組肝臟的PepT1 mRNA 的相對表達(dá)量最低，可能是因?yàn)楦呔弦鸶闻K合成小肽減少導(dǎo)致的。

綜合分析結(jié)果表明，精粗比為65∶35 的全價顆粒飼料能促進(jìn)消化道GLUT1 基因的表達(dá)，精粗比為75∶25 的全價顆粒飼料能促進(jìn)消化道FATP4、PepT1 基因的表達(dá)。從整體上看，精粗比為65∶35的全價顆粒飼料更有利于犢牛對葡萄糖、脂肪酸和蛋白質(zhì)的吸收。

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