昌文林，張達(dá)軍，袁安文，楊青，薛立群*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)a.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；b.動(dòng)物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.益陽市農(nóng)科所，湖南 益陽 413046)

根據(jù)組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，豬胎盤屬于典型的上皮絨毛膜型胎盤，因此，供給子宮組織營養(yǎng)的質(zhì)與量對(duì)妊娠過程中胚胎的發(fā)育和存活具有重大影響。梅山豬所具有的優(yōu)秀LS性狀種質(zhì)特征與其子宮組織營養(yǎng)中一些關(guān)鍵組分含量顯著相關(guān)[1–4]。維生素A影響基因轉(zhuǎn)錄、胞外基質(zhì)合成和多種生長因子及其受體的表達(dá)[5]。妊娠第12天母豬子宮腺體和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞就可合成維生素A的結(jié)合蛋白R(shí)BP (retinol binding protein)，且結(jié)合蛋白的合成量隨妊娠進(jìn)程的表達(dá)而遞增[5]。孕體亦早在妊娠第15天就在滋養(yǎng)層合成RBP，從第25天開始，RPB在子宮腺窩處的高柱狀胎盤暈滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞呈高豐度表達(dá)[6–8]。母體視黃醇通過與視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合的形式被分泌到子宮腔中，構(gòu)成子宮組織營養(yǎng)的重要組份[9–10]。孕體胎盤乳暈滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)的RBP交換結(jié)合子宮RBP攜帶的視黃醇，實(shí)現(xiàn)母胎間的視黃醇轉(zhuǎn)運(yùn)[11]，因此，子宮組織營養(yǎng)中RBP4的質(zhì)和量通過影響母胎間維生素A的轉(zhuǎn)運(yùn)效率來對(duì)胎兒的發(fā)育和抗脅迫保護(hù)發(fā)揮重要作用，對(duì)提高動(dòng)物多胎性能具有積極意義[12–14]。RBP4基因被視為母豬LS性狀的重要候選基因[15]。

RBP4基因中一個(gè)Msp Ⅰ RFLP (SNP G1223C)與母豬LS性狀顯著相關(guān)[16–21]，但哪一等位基因?yàn)長S性狀的優(yōu)勢(shì)等位基因存在爭議[17–21]，甚至RBP4 Msp Ⅰ RFLP 是否與LS性狀顯著相關(guān)也存在著不同的研究結(jié)論[18，22]?；谶@一現(xiàn)象，筆者提出如下假設(shè)：在RBP4基因Msp Ⅰ RFLP 位點(diǎn)附近可能存在一個(gè)與其連鎖的功能性的多態(tài)性位點(diǎn)。為此，筆者利用家豬Unigene database中來源廣泛的序列資源，進(jìn)一步對(duì)RBP4基因外顯子區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)，并對(duì)其與LS性狀的關(guān)聯(lián)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本與數(shù)據(jù)的采集

分別采集97頭大白豬和144頭湖南黑豬的耳組織樣品，并對(duì)應(yīng)收集大白豬4年間的繁殖記錄和湖南黑豬3年的繁殖記錄。大白豬來自一個(gè)開放–核心育種群的專門化母系群體。湖南黑豬是一個(gè)雜合母系群體，具有杜洛克和湘西黑豬桃源地方類群遺傳背景。

1.2 方法

1.2.1 RBP4 基因外顯子區(qū)域SNP 的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

從NCBI Unigene 數(shù)據(jù)庫中分別下載豬RBP4基因的EST序列，刪除低質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。采用在線工具M(jìn)ultAlin[23]，以Genebank 中相應(yīng)基因的參考mRNA(XM_005671295)序列為基準(zhǔn)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，篩選RBP4外顯子區(qū)域的候選SNPs(每個(gè)等位基因至少在3條以上的不同EST序列中出現(xiàn)時(shí)才判讀為陽性預(yù)測(cè)結(jié)果)。

1.2.2 基因組DNA 的提取和RBP4 基因片段的擴(kuò)增

用普通的蛋白酶K消化和苯酚/氯仿法，從母豬耳組織中提取基因組DNA樣品作為靶標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的模板。

RBP4基因片段擴(kuò)增用引物沿用文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的引物或利用Primer 5.0 基于目標(biāo)基因參考mRNA 序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體序列見表1。引物購自英俊公司(廣州)。PCR反應(yīng)體積為30 μL，各組份用量和濃度分別為：正向和反向引物終濃度分別為0.2 μmol/L，10×反應(yīng)緩沖液(不含Mg2+)3 μL，Mg2+濃度為2 mmol/L，dNTPs混合物濃度為0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1.5 U (MBI，USA)，DNA模板添加量為100 ng。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃下模板變性30 s，55℃下引物與模板退火30 s，72℃下延伸30 s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃下延伸10min，然后降溫到4℃結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。利用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。–20℃保存PCR產(chǎn)物用于后續(xù)基因分型。

表1 RBP4基因SNPs檢測(cè)的2對(duì)PCR引物序列 Table 1 Two pairs of PCR primer for SNPs detection in RBP4gene

1.2.3 多態(tài)性位點(diǎn)驗(yàn)證和個(gè)體基因分型

利用PCR RFLP對(duì)湖南黑豬和大白豬群體各母畜的RBP4 SNPs位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體基因型檢測(cè)和驗(yàn)證。特異性限制性內(nèi)切酶MspⅠ和Eco 24Ⅰ購自美國MBI公司。酶切反應(yīng)體積為10 μL，其中PCR產(chǎn)物添加量為3 μL。酶切反應(yīng)各有效組份和反應(yīng)溫度按照產(chǎn)品操作手冊(cè)確定。酶切反應(yīng)時(shí)間為16 h。4℃終止酶切消化后，取5 μL酶切后產(chǎn)物進(jìn)行2.5%的瓊脂糖凝膠電泳，判讀母畜個(gè)體的基因型。采取Msp RFLPⅠ 對(duì)RBP4 SNP G1223C進(jìn)行基因分型。采用Eco 24 RFLPⅠ 對(duì)SNP G1027A進(jìn)行個(gè)體基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)分析中的LS性狀包括窩產(chǎn)仔數(shù)(TNB，total number born)和產(chǎn)活仔數(shù)(NBA，number born alive)。利用fastPHASE構(gòu)建RBP4基因的單倍型，并對(duì)單倍型與母畜LS性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。利用SAS8.0(SAS Institute，Inc.，Cary，NC，USA)一般線性模型，比較各基因型母豬對(duì)應(yīng)的產(chǎn)仔性狀的最小二乘均數(shù)，從而進(jìn)行基因型與性狀間的相關(guān)性分析。對(duì)TNB或NBA的統(tǒng)計(jì)模型中，包括的固定效應(yīng)有窩次、品種/系、基因型和品系互作效應(yīng)。母豬效應(yīng)和殘留效應(yīng)被視為隨機(jī)效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)模型為：性狀表現(xiàn)型效應(yīng)＝群體均數(shù)＋基因型效應(yīng)＋品種效應(yīng)＋胎次效應(yīng)＋殘差。

通過純合子母體的性狀值比較來估計(jì)加性遺傳效應(yīng)(c，additivegenetic effect)。顯性遺傳效應(yīng)(d dominantgenetic effect)估計(jì)為雜合子與2種純合子的平均值之差，并用t–檢驗(yàn)對(duì)遺傳效應(yīng)進(jìn)行顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBP4 外顯子區(qū)域基因候選SNPs

根據(jù)EST多序列比對(duì)結(jié)果，預(yù)測(cè) RBP4基因(NC_010456.4)外顯子區(qū)域存在5個(gè)候選SNPs(表2)，其 中 有3個(gè)SNPs 是 在RBP4 基 因CDS(coding sequence)區(qū)(2個(gè)是錯(cuò)義突變，1個(gè)為同義突變)。預(yù)測(cè)結(jié)果還顯示，同義突變A1027G(圖1–B)與已報(bào)道的RBP4基因Msp ⅠR FLP(圖1–A，由內(nèi)含子2中SNP G1223C產(chǎn)生)臨近，位于近臨的外顯子3中，與RBP4基因SNP G1223C緊密連鎖。

表2 RBP4(NC_010456.4)基因外顯子區(qū)的候選SNPs Table 2 Candidate SNPs of RBP4gene at exonic zone

圖1 RBP4 Msp Ⅰ RFLP 和Eco 24 ⅠR FLP瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Fig.1 Results of agrosegel electrophoresis for RBP4 G1223C and G1027Agenotyping

2.2 RBP4 基因SNP G1223C 與母豬LS 性狀的相關(guān)性

RBP4 SNP G1223C與湖南黑豬和大白豬母豬LS性狀顯著相關(guān)(表3)。在湖南黑豬群體中，GG基因型母體的TNB和NBA都顯著高于CC基因型母體(P＜0.05)，雜合型母體的性狀值居于2種純合基因型個(gè)體的平均值之間；基因加性效應(yīng)每個(gè)窩次達(dá)0.7個(gè)仔豬(P＜0.05)。在大白豬群體中，GG基因型母豬比CC基因型母體每窩次平均多產(chǎn)0.94頭仔豬，但是CC純合型和雜合型個(gè)體LS性狀值間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 豬RBP4 基因 SNP G1223C 與母豬LS 性狀的相關(guān)性分析結(jié)果 Table 3 Correlation analysis between SNP G1223C and LS traits of sow

2.3 RBP4 基因SNP G1027A 與母豬LS 性狀的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(表4)表明，對(duì)于TNB和NBA這2項(xiàng)指標(biāo)，湖南黑豬群體RBP4 G1027A位點(diǎn)各基因型母畜對(duì)應(yīng)的性狀值均表現(xiàn)出AA純合子母體最優(yōu)、雜合子次之的趨勢(shì)，但在本試驗(yàn)檢測(cè)群體中，各基因型性狀值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2種純合基因型母畜平均TNB和NBA的差值分別達(dá)每窩次0.71、0.60頭。在大白豬群體中，這種差異不明顯。2個(gè)動(dòng)物群體數(shù)據(jù)的合并分析結(jié)果顯示，SNP G1027A與母豬LS性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)，并在TNB和NBA性狀平均值上都表現(xiàn)為AA純合子最優(yōu)、GA雜合子次之的趨勢(shì)?；蚣有孕?yīng)中等，在TNB和NBA上分別估值為0.375和0.385。與GG純合子相比，優(yōu)勢(shì)等位基因A為AA純合基因型母畜在TNB和NBA上平均每窩次分別多貢獻(xiàn)了0.72和0.77頭 (P＜0.05) 。

表4 RBP4 基因SNP G1027A 與母豬LS 性狀的相關(guān)性分析結(jié)果 Table 4 Correlation analysis between RBP4 SNP G1027A and LS traits of sow

2.4 RBP4 基因單倍型和母豬LS 性狀的相關(guān)性

基于RBP4 SNPs G1027A與G1223C的個(gè)體基因分型結(jié)果，利用軟件fastPHASE[24]分析大白豬群體和湖南黑豬群體的單倍型結(jié)果，再對(duì)單倍型與母畜LS性狀進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果(表5)表明，RBP4基因單倍型與母豬LS性狀呈顯著相關(guān)。在2個(gè)群體中，RBP4基因AG單倍型都表現(xiàn)出較優(yōu)秀的LS性狀值。與AC、GG和GC單倍型相比，湖南黑豬AG單倍型在TNB上每窩次分別多1.21、1.21和1.85(P＜0.05)頭仔豬，而大白豬群體中每窩次分別多1.08(P＜0.05)、0.96(P＜0.05)、1.38(P＜0.05)頭仔豬。在NBA表現(xiàn)上，湖南黑豬的AG單倍型相對(duì)于AC、GG和GC單倍型每 窩次 分 別 多1.51(P＜0.05) 、 1.45(P＜0.05) 和1.97(P＜0.01)頭仔豬，大白豬群體中每窩次分別多0.39、0.58和1.23 (P＜0.01)頭仔豬。2個(gè)動(dòng)物群體的合并分析結(jié)果顯示，母畜LS性狀表現(xiàn)從高到低依次為 AG、AC、GG、GC。優(yōu)勢(shì)單倍型AG在TNB上相對(duì)于另3種單倍型每窩次分別表現(xiàn)出0.66、0.94 (P＜0.05)、1.36 (P＜0.01)頭仔豬；優(yōu)勢(shì)單倍型AG在NBA上相對(duì)于另3種單倍型每窩次分別表現(xiàn)出0.39、0.58、1.23 (P＜0.01)頭仔豬的優(yōu)勢(shì)。

表5 由RBP4基因SNPs G1027A和G1223C構(gòu)建的單倍型與母豬LS性狀的相關(guān)性分析結(jié)果 Table 5 Correlation analysis between the constructed haplotypes (based on RBP4gene SNPs G1027A and G1223C )and LS traits of sow

3 結(jié)論與討論

動(dòng)物分子育種的一個(gè)重要目標(biāo)就是發(fā)現(xiàn)家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的內(nèi)在遺傳調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的主效基因，進(jìn)一步開發(fā)出可以有效實(shí)現(xiàn)性狀遺傳改進(jìn)的分子標(biāo)記[16，25]。Rothchild等[15]首先在RBP4基因開發(fā)了一個(gè)Msp RFⅠ LP標(biāo)記，并基于對(duì)6個(gè)品系共 1 300頭母豬和對(duì)應(yīng)的2 755個(gè)窩次的分析，證明其與母畜LS性狀顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)等位基因A為LS性狀優(yōu)勢(shì)等位基因。本研究在大白豬和湖南黑豬群體中也得到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)RBP4基因Msp Ⅰ RFLP 標(biāo)記檢測(cè)中等位基因A為LS性狀有利等位基因。SNP G1027A是一個(gè)同義SNP，這一多態(tài)性位點(diǎn)以高頻率狀態(tài)存在于所檢測(cè)的湖南黑豬和大白豬群體中，性狀相關(guān)性分析結(jié)果表明RBP4 Msp Ⅰ RFLP是一個(gè)有價(jià)值的LS性狀相關(guān)分子標(biāo)記。

RBP4基因單倍型與母豬LS性狀相關(guān)性分析的結(jié)果進(jìn)一步表明，采用SNPs G1027A和G1223C (RBP4 Msp Ⅰ RFLP)2個(gè)位點(diǎn)的單倍型進(jìn)行選擇，可以預(yù)期獲得更大的LS性狀選擇進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，RBP4基因G1027A和G1223C組成的單倍型在對(duì)應(yīng)LS性狀上的表現(xiàn)從高到低依次為AG，AC，GG和GC，單倍型AG在TNB和NBA性能水平上顯現(xiàn)出相對(duì)優(yōu)勢(shì)。

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