黃建龍，王昌建，鄧國(guó)華，范仲鑫，何世成，朱春霞，唐小明，劉道新*

(1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長(zhǎng)沙410014；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001)

2000年以來(lái)，美國(guó)多次暴發(fā)H6 亞型禽流感，從散養(yǎng)的家禽和商品雞均分離出了禽流感病毒[1–2]。在中國(guó)，H6 亞型是禽流感流行病學(xué)調(diào)查研究中分離數(shù)量最多的亞型之一，占所有禽流感病毒亞型的17.8%[3]。有報(bào)道稱H6 亞型禽流感病毒不僅可以向H5 亞型高致病性禽流感病毒和H9N2 亞型禽流感病毒提供內(nèi)部基因片段，而且還可以感染鼠、水貂、豬和人[4–6]，表明H6 亞型禽流感病毒具有跨越種屬障礙而感染哺乳動(dòng)物甚至感染人的潛在危險(xiǎn)，因此，加強(qiáng)H6 亞型禽流感病毒的監(jiān)測(cè)和研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。筆者于2009—2013年對(duì)環(huán)洞庭湖區(qū)活禽批發(fā)市場(chǎng)和水禽場(chǎng)進(jìn)行H6 亞型禽流感監(jiān)測(cè)，分析該地區(qū)H6 亞型禽流感的分布和流行趨勢(shì)，旨在為該地區(qū)科學(xué)制定H6 亞型禽流感的防控措施，保護(hù)人體健康和公共衛(wèi)生安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和DNA 分子量Marker 均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、LS TRIzol RNA 提取試劑購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.2 雞胚

SPF 雞胚購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 樣品采集

在活禽批發(fā)市場(chǎng)上采用隨機(jī)抽樣的方法,于2009—2011年每年的冬季和春季到長(zhǎng)沙市楊家山家禽批發(fā)市場(chǎng)、長(zhǎng)沙市石馬家禽批發(fā)市場(chǎng)、益陽(yáng)學(xué)門(mén)口市場(chǎng)、常德美江市場(chǎng)和岳陽(yáng)楓橋湖蛋禽批發(fā)市場(chǎng)分別抽取10個(gè)經(jīng)營(yíng)戶，每戶采10 對(duì)咽喉拭子和泄殖腔拭子，共采集2 819 對(duì)拭子。

2011—2013年，在水禽場(chǎng)采用多級(jí)抽樣的方法，通過(guò)WinEpiscope 2.0 軟件中的Samples–Estimate Percentage 計(jì)算(隨機(jī)抽樣；置信水平為90%，可接受誤差為7%，預(yù)期場(chǎng)群間陽(yáng)性率為10%)，每次需抽取50個(gè)水禽場(chǎng)(群)。根據(jù)洞庭湖在湖南的分布特點(diǎn)(分為東洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖)，每次選取靠近東洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖各1個(gè)縣進(jìn)行取樣，每個(gè)縣每次需要采集15～17個(gè)水禽場(chǎng)。再通過(guò) ProMES 軟件中的 Detect–Sample Size– Simple Random Sample 計(jì)算(隨機(jī)抽樣；置信水平為95%，發(fā)生II 類錯(cuò)誤的可能性為5%，預(yù)期個(gè)體陽(yáng)性率為10%，檢測(cè)方法的敏感性和特異性都為95%)，如發(fā)現(xiàn)1 釆個(gè)陽(yáng)性樣品，則需要在每個(gè)場(chǎng) 集29 份水禽拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)在每個(gè)場(chǎng)抽取10 份環(huán)境拭子進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 病原分離和鑒定

將拭子樣品1 000 r/min 離心5min，吸取上清液，以每胚0.2mL 的注射劑量由尿囊腔接種9～10日齡SPF 雞胚，每個(gè)樣品接種2～3 枚SPF 雞胚，37℃孵育，每天觀察2次，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，及時(shí)收集孵育24 h 之后死亡的雞胚，孵育至96 h 時(shí)收集所有雞胚，置于4℃過(guò)夜，收獲雞胚尿囊液，用血凝試驗(yàn)(HA)檢測(cè)是否有禽流感病毒[7]。測(cè)定為禽流感陰性(無(wú)滴度)的尿囊液再盲傳一代。HA 測(cè)定為陰性的定為陰性樣品。對(duì)HA 測(cè)定為禽流感陽(yáng)性(有滴度)的再進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(HI)和RT–PCR 檢測(cè)，以鑒定該病毒是否為H6 亞型禽流感病毒。

1.5 陽(yáng)性場(chǎng)判定標(biāo)準(zhǔn)

采用國(guó)家推薦的RT–PCR 檢測(cè)方法，將場(chǎng)內(nèi)至少檢出1個(gè)H6 亞型禽流感陽(yáng)性個(gè)體的定為陽(yáng)性場(chǎng)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

群體陽(yáng)性率=陽(yáng)性群體數(shù)/采樣場(chǎng)數(shù)；病毒分離率=病毒分離數(shù)/采集的拭子樣品數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活禽批發(fā)市場(chǎng)H6亞型禽流感監(jiān)測(cè)及分離情況

2009—2011年，對(duì)環(huán)洞庭湖區(qū)主要活禽批發(fā)市場(chǎng)禽流感進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)采集的2 819 對(duì)拭子，采用HI 和RT–PCR 鑒定，共分離到183 株H6 亞型禽流感病毒，總的分離率為6.49%。分別在雞、鴨、鵝拭子中分離到H6 亞型禽流感病毒69、106、8 株，其分離率分別為4.11%、9.58%和23.53%。

在所監(jiān)測(cè)的5家活禽批發(fā)市場(chǎng)中都分離出了H6 亞型禽流感病毒，其中長(zhǎng)沙市石馬家禽批發(fā)市場(chǎng)、益陽(yáng)學(xué)門(mén)口市場(chǎng)和常德美江市場(chǎng)的H6 亞型禽流感分離率較高，分別為10.17%、8.82%和8.05%，具體情況見(jiàn)表1。

表1 各個(gè)活禽批發(fā)市場(chǎng)H6 亞型禽流感的分離情況 Table 1 Separation of H6, a subtype AIV in different wholesale markets of live poultry

2.2 洞庭湖區(qū)水禽場(chǎng)H6 亞型禽流感檢測(cè)及分離情況

先后于2011年11月、2012年3月和11月、2013年6月對(duì)東洞庭湖、南洞庭湖和西洞庭湖區(qū)的水禽場(chǎng)進(jìn)行禽流感監(jiān)測(cè)的結(jié)果表明，在195個(gè)水禽場(chǎng)中，有7個(gè)水禽場(chǎng)檢測(cè)到H6 亞型禽流感病毒，群體陽(yáng)性率為3.6%。在采集的鴨拭子和環(huán)境拭子7 311 對(duì)中，有13 對(duì)鴨拭子和8 對(duì)環(huán)境拭子分離到H6 亞型禽流感病毒，拭子的病毒分離率為0.29%，具體見(jiàn)表2。

表2 水禽場(chǎng)H6 亞型禽流感的監(jiān)測(cè)情況 Table 2 The detection of H6 in waterfowl field

2.3 洞庭湖區(qū)水禽場(chǎng)混合感染情況

在4次持續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中，在7個(gè)水禽場(chǎng)檢測(cè)到H6 亞型禽流感病毒，其中發(fā)現(xiàn)1個(gè)水禽場(chǎng)為H4 和H6 兩種亞型禽流感病毒混合感染。

3 結(jié)論與討論

2009—2011年連續(xù)3年都在環(huán)洞庭湖區(qū)活禽批發(fā)市場(chǎng)上分離到H6 亞型禽流感，總的分離率為6.49%，并在所監(jiān)測(cè)的5家活禽批發(fā)市場(chǎng)中都有檢出H6 禽流感陽(yáng)性樣品，表明在活禽批發(fā)市場(chǎng)中家禽隱性帶毒H6 亞型禽流感的情況普遍存在?；钋菖l(fā)市場(chǎng)鴨拭子的H6 亞型禽流感病毒分離率為9.58%，水禽場(chǎng)拭子的H6 亞型病毒分離率為0.29%，表明市場(chǎng)環(huán)節(jié)水禽H6 亞型禽流感隱性帶毒率比養(yǎng)殖環(huán)節(jié)高。彭宜等[8]的研究顯示，在活禽批發(fā)市場(chǎng)的鴨中H6 亞型低致病性禽流感占的比例最高，在一定程度上說(shuō)明禽流感在活禽批發(fā)市場(chǎng)存在水平傳播的風(fēng)險(xiǎn)，但是市場(chǎng)中的風(fēng)險(xiǎn)因素是什么？是怎么傳播的還需進(jìn)一步研究。這同時(shí)也提示我們需要對(duì)活禽批發(fā)市場(chǎng)中家禽的病原學(xué)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，做好市場(chǎng)內(nèi)車(chē)輛等運(yùn)輸工具及市場(chǎng)內(nèi)環(huán)境的消毒工作，提高家禽批發(fā)市場(chǎng)的禽流感防控水平，防止禽流感疫情的發(fā)生和傳播。

水禽特別是家鴨是禽流感病毒的儲(chǔ)存庫(kù)和傳染源。由于家鴨經(jīng)常同時(shí)被多個(gè)亞型的禽流感病毒混合感染，這為各亞型的基因重組提供了便利。禽流感病毒在水禽與陸禽間傳播，可加快表面蛋白的變異，不斷豐富內(nèi)部基因的重配，并加大種間傳播的機(jī)會(huì)[9–10]。張曦等[11]在H6N8 亞型禽流感SPF 雞感染試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H6N8 亞型禽流感有能力在水禽和家禽間跨種傳播，增加鴨源H6 亞型AIV 在種家禽之間發(fā)生重組和傳播的機(jī)會(huì)。筆者對(duì)洞庭湖區(qū)水禽場(chǎng)H6 亞型禽流感監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示，水禽場(chǎng) H6亞型禽流感病毒場(chǎng)間陽(yáng)性率達(dá)到3.6%，拭子的H6亞型病毒分離率為0.29%，說(shuō)明水禽場(chǎng)H6 亞型禽流感的隱性帶毒率較高。在宿主混合感染AIV 的條件下，有可能引起AIV 發(fā)生基因突變和重組，改變其生物學(xué)特性[12]。筆者在1個(gè)鴨場(chǎng)監(jiān)測(cè)到有H4 和H6 兩種禽流感病毒混合感染，這提示洞庭湖區(qū)的水禽場(chǎng)禽流感基因重組的幾率增高，可能加大種間傳播的機(jī)會(huì)，加大禽流感防控的難度。

H6 亞型禽流感病毒主要宿主是野鳥(niǎo)。湖南洞庭湖地區(qū)作為“東亞–澳大利亞遷徙線”上候鳥(niǎo)和中國(guó)候鳥(niǎo)遷徙主要停歇地，野鳥(niǎo)的遷徙對(duì)H6 亞型禽流感的散播起到很大作用[13]。有研究[14]顯示，在湖水中禽流感病毒在22℃，4 d 以內(nèi)或0℃，30 d 以內(nèi)仍具有感染性，表明禽流感病毒可通過(guò)被污染的水在家禽與野禽之間相互傳播。筆者在水禽場(chǎng)的環(huán)境拭子中也監(jiān)測(cè)到H6 亞型禽流感病毒，因此，要加強(qiáng)洞庭湖區(qū)水禽和野鳥(niǎo)的H6 亞型禽流感的監(jiān)測(cè)，并且要做好水禽場(chǎng)環(huán)境的消毒工作。

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