于金玲， 沈衛(wèi)達， 龔 波， 徐錦屏， 高蓓敏， 趙海燕

(上海市長寧區(qū)婦幼保健院乳腺科，上海 200051)

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·基礎(chǔ)研究·

miR-182在三陰性乳腺癌中的表達及意義

于金玲， 沈衛(wèi)達， 龔 波， 徐錦屏， 高蓓敏， 趙海燕

(上海市長寧區(qū)婦幼保健院乳腺科，上海 200051)

目的 探討miR-182在三陰性乳腺癌中的表達及意義。方法 收集30例石蠟包埋的三陰性乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織標本,并收集患者的基本資料。RT-PCR測定miR-182的相對表達，分析miR-182在TNBC中的表達與腫瘤的大小、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、無疾病生存率、總生存率等的相關(guān)性。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果提示，癌組織中miR-182表達為癌旁組織的8.6倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。miR-182在淋巴結(jié)陽性及TNM分期Ⅲ期中表達高于淋巴結(jié)陰性(Z=-3.454,P=0.001)及TNM(Ⅰ+Ⅱ)期者(Z=-3.946,P=0.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；COX回歸多因素分析顯示，miR-182高表達(HR=0.107，95%CI: 0.018～0.643，P=0.015)、淋巴結(jié)陽性(HR=0.189，95%CI: 0.020～1.757，P=0.016)、脈管瘤栓(HR=0.190，95%CI: 0.020～1.826，P=0.008)、Ki67≥14%(HR=0.182，95%CI: 0.041～0.801，P=0.024)、TNM分期(Ⅲ期)(HR=0.501，95%CI: 0.044～5.741，P=0.001)是獨立的預(yù)后因子。結(jié)論miR-182在三陰性乳腺癌中表達上調(diào),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，miR-182高表達是三陰性乳腺癌獨立的預(yù)后因素之一，與預(yù)后差相關(guān)。

三陰性乳腺腫瘤；miR-182； 預(yù)后； 侵襲

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是雌激素受體、孕激素受體和表皮生長因子受體-2表達均陰性的一類乳腺癌，惡性程度高，預(yù)后差，超過5年生存期的患者不到30%。研究表明[1]，TNBC并不是單一的疾病，而是在分子、病理學(xué)和臨床水平上異質(zhì)性的疾病，不同的組織學(xué)亞型具有不同的生物學(xué)行為。近年發(fā)現(xiàn)某些特異性miRNA在乳腺癌中表達上調(diào)或下調(diào)，但目前關(guān)于miRNAs與TNBC臨床病理及預(yù)后之間的相關(guān)性研究并不多見。本研究選擇三陰性乳腺癌為研究對象，研究miR-182表達與三陰性乳腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，探討其作為臨床侵襲性及預(yù)后判斷標準的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月至2013年1月在上海市長寧區(qū)婦幼保健院行乳腺癌改良根治的三陰性乳腺癌患者共30例，入選病例均有完整臨床隨訪資料，術(shù)前未接受過放療及化療，全部標本經(jīng)組織病理學(xué)證實，術(shù)后輔助化療采用TAC方案(吡柔比星+環(huán)磷酰胺+多西他賽)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥3個或腫瘤大小≥5cm者予以胸壁+鎖骨上區(qū)放療?；颊甙l(fā)病年齡為31～73歲，中位發(fā)病年齡為51.1歲。

1.2 主要試劑和儀器

石蠟組織總RNA提取試劑盒(Recover-ALLTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit)購自美國ABI公司；RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green Ⅰ熒光試劑盒購自丹麥Exiqon公司；hsa-miR-182引物、內(nèi)參U6由丹麥Exiqon公司合成。酶標儀(DU-600型分光度計)購自Beckman公司產(chǎn)品，Real Time PCR儀(ABI 7500)購自美國Ambion公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 蠟塊組織中提取RNA 將石蠟包埋的組織切成≥20μm的薄片，取≤80μm的石蠟組織，常規(guī)脫蠟，蛋白酶消化，按照蠟塊組織提取試劑盒說明書進行，離心柱洗脫出總RNA。檢測RNA溶液吸光值D260、D280，計算RNA濃度和純度，D260、D280比值介于1.8～2.1方可用于cDNA合成。2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，RNA存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 cDNA合成 所有模板RNA濃度調(diào)至110mg/L，5×Reaction buffer 4μl+Enzyme mix 2μl+Nuclease-free water 10μl+模板總RNA 4μl共20μl體系，反應(yīng)條件為: 42℃ 60min，95℃ 5min。

1.3.3 Real-Time PCR 以第一鏈cDNA為模板應(yīng)用特定加尾結(jié)構(gòu)的引物進行，Real-Time PCR擴增，hsa-miR-182結(jié)構(gòu)為如下。 GSP: 5′-GGCTTTG-GCAATGGTAGAAC-3′,R: 5′-GTGCGTGTCGT-GGAGTCG-3′(GSP是對應(yīng)miRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物)。PCR擴增體系為: cDNA 8μl，SYBR Green master mix 10μl，PCR mix 2μl；反應(yīng)條件: 50℃ 2min，95℃ 10min，預(yù)變性；95℃變性15s，60℃退火1min；72℃延伸30s，40個循環(huán)。

1.3.4 CT值計算 記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即CT值，以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1miR-182表達水平與三陰性乳腺癌臨床病理指標的關(guān)系

全部病理切片均經(jīng)組織學(xué)證實。復(fù)發(fā)患者為手術(shù)后隨訪中發(fā)生局部復(fù)發(fā)和(或)遠處轉(zhuǎn)移的患者。RT-PCR結(jié)果提示癌組織中miR-182表達水平明顯高于癌旁正常組織(9.01±5.11vs1.06±0.46，t=-8.41，P=0.000)。經(jīng)MannWhitney-U非參數(shù)檢驗，三陰性乳腺癌中淋巴結(jié)陽性者miR-182表達水平明顯高于淋巴結(jié)陰性者(Z=-3.454，P=0.001)；TNM分期Ⅲ期中表達高于TNM(Ⅰ+Ⅱ)期者(Z=-3.946,P=0.000)，有脈管瘤栓的高于無脈管瘤栓者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.247,P=0.001)。在隨訪中復(fù)發(fā)的三陰性乳腺癌中，miR-182表達水平顯著高于無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌(Z=-2.408，P=0.016)；同時未發(fā)現(xiàn)其與組織學(xué)分級、腫瘤大小、是否基底樣癌、月經(jīng)狀態(tài)、ki67指數(shù)之間存在顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.2 Cox回歸多因素分析結(jié)果

miR-182高表達(HR=0.107，95%CI: 0.018～0.643，P=0.015)、淋巴結(jié)陽性(HR=0.189，95%CI: 0.020～1.757，P=0.016)、脈管瘤栓(HR=0.190，95%CI: 0.020～1.826，P=0.008)、Ki67≥14%(HR=0.182，95%CI: 0.041～0.801，P=0.024)、TNM分期(Ⅲ期)(HR=0.501，95%CI: 0.044～5.741，P=0.001)是影響總生存的獨立預(yù)后因子，見表2。

表1 miR-182表達水平與三陰性乳腺癌臨床病理指標的關(guān)系Tab.1 Correlations between miR-182 expression and clinicopathological parameters in TNBC

表2 三陰性乳腺癌臨床病理指標多因素生存分析Tab.2 Cox proportional hazards regression analysis in TNBC

2.3miR-182表達與三陰性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系

以中位數(shù)2-ΔΔCt=7.37作為截斷值，Kaplan-Meier生存分析表明，miR-182高表達組無復(fù)發(fā)生存率明顯降低(X2=4.084，P=0.043)，見圖1。

圖1 miR-182表達水平與三陰性乳腺癌生存率的關(guān)系Fig.1 Correlations between miR-182 expression and overall survival in TNBC patients

3 討 論

miRNAs是具有約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過促進靶基因mRNA的降解或抑制翻譯而調(diào)節(jié)靶基因的功能，在細胞的增殖、發(fā)育、分化、代謝、凋亡、衰老和腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。特異性miRNA的差異表達與某些腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛在預(yù)測指標。

三陰性乳腺癌侵襲性強、復(fù)發(fā)早、預(yù)后差、遠處轉(zhuǎn)移率高，缺乏內(nèi)分泌及抗HER-2治療靶點，是乳腺癌治療的難點。目前，關(guān)于miR-182與TNBC的研究并不很多。Liu等[2]報道了miR-182促進TNBC細胞的增殖和遷移，抑制其凋亡等；Lei等[3]研究表明，miR-182的高表達與乳腺癌的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-182在TNBC中表達上調(diào)；進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-182在淋巴結(jié)陽性及TNM分期Ⅲ期中表達高于淋巴結(jié)陰性及TNM分期(Ⅰ+Ⅱ)患者(P<0.001)；多因素回歸分析表明，miR-182高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、ki-67指數(shù)是三陰性乳腺癌獨立的預(yù)后因素。有研究[3]表明，miR-182在乳腺癌細胞中上調(diào)、活化RhoA蛋白，促進乳腺癌的侵入和轉(zhuǎn)移。乳腺癌細胞中，miR-182通過β-catenin信號通路上調(diào)，抑制RECK而增加致瘤性和侵入性。miR-182的表達在TNBC組織和細胞中顯著增加，促進TNBC細胞的增殖和遷移，抑制其凋亡等[4]。本研究結(jié)果進一步印證了上述結(jié)論，提示miR-182很可能參與TNBC的發(fā)生發(fā)展，其高表達與TNBC侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與TNBC的預(yù)后相關(guān)。Toyama等[5]研究表明，miR-210的高表達與TNBC無疾病生存率和總生存率呈負相關(guān)。Svoboda等[6]表明，miR-34b的高表達與TNBC無疾病生存和總生存負相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-182高表達組無復(fù)發(fā)生存率明顯降低(P<0.05)，與TNBC預(yù)后不良有關(guān)。由于三陰性乳腺癌預(yù)后的影響因素是多方面的，miR-182作為潛在的預(yù)后因子還需要仔細評估。

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Expression of microRNA-182 in triple-negative breast cancer and its clinicopathological significance

YUJin-ling，SHENWei-da，GONGBo，XUJin-ping,GAOBei-min，ZHAOHai-yan

(Dept. of Breast Surgery， Changning District Maternal and Infant Health Hospital， Shanghai 200051, China)

Objective To investigate the expression of microRNA-182(miR-182) in triple-negative breast cancer(TNBC) and its clinicopathological significance. Methods Thirty patients with triple-negative breast cancer underwent mastectomy, and the surgical specimens were collected. Quantitative Real-Time polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the expression ofmiR-182 in cancer tissues and pericancerous tissue. And the relationship betweenmiR-182 expression in TNBC cancer tissues and clinicopathological characteristics, including tumor size, grade, lymph node metastasis, distant metastases, TNM staging, disease-free survival, distant metastasis-free survival, overall survival were analyzed. Results RT-PCR results indicated that the expression ofmiR-182 in cancer tissue was 8.6 times higher as that in pericancerous tissue (P<0.001). In cases of lymph node positive and TNM stage Ⅲ, the expression ofmiR-182 was higher than those of lymph node negative(Z=-3.454,P=0.001) and TNM stage(Ⅰ+Ⅱ)(Z=-3.946,P=0.000)．Cox proportional hazards risk analysis indicated that the high expression ofmiR-182(HR=0.107,95%CI: 0.018-0.643,P=0.015), positive lymph nodes(HR=0.189,95%CI: 0.020-1.757,P=0.016), lymphovascular invasion(HR=0.190,95%CI: 0.020-1.826,P=0.008), Ki67≥14%(HR=0.182,95%CI: 0.041-0.801,P=0.024), TNM staging Ⅲ(HR=0.501,95%CI: 0.044-5.741,P=0.001) were the independent prognostic factors for TNBC. Conclusion The expression ofmiR-182 is up-regulated in TNBC, which is correlated with positive regional lymph nodes metastasis and advanced TNM stage. The high expression ofmiR-182 is one of the independent prognostic factors of TNBC, associated with poor prognosis.

triple negative breast cancer；miR-182； prognosis； invasion

10.16118/j.1008-0392.2015.04.006

2015-02-23

于金玲(1976—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail： yjl152152@163.com

R 737.9

A

1008-0392(2015)04-0029-04