魏飛宇， 成 燕， 李 進， 肖俊杰， 周 蕾

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科，南京 210029； 2. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院心身科，上海 200065；3. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

?

·基礎(chǔ)研究·

含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5真核表達載體的構(gòu)建及初步功能研究

魏飛宇1， 成 燕2， 李 進3， 肖俊杰3， 周 蕾1

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科，南京 210029； 2. 同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院心身科，上海 200065；3. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444)

目的 構(gòu)建含小鼠FNDC5基因的綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C3-FNDC5，并初步探索其對C2C12肌細胞的線粒體能量代謝的影響。方法 應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法從小鼠腓腸肌和心臟組織中擴增出兩端帶有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點的FNDC5編碼片段，經(jīng)回收、純化酶切后，依次連接到質(zhì)粒PMD19-T和pEGFP-C3上，獲得過表達載體后轉(zhuǎn)染至C2C12肌細胞，48h后以激光共聚焦顯微鏡拍攝線粒體熒光強度，以熒光定量PCR檢測與線粒體能量代謝相關(guān)的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表達情況。結(jié)果 PCR及測序結(jié)果表明: 重組質(zhì)粒pEGFP-C3含有FNDC5段，方向及大小正確，過表達FNDC5可以增強線粒體熒光強度，并增加線粒體能量代謝相關(guān)的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表達。結(jié)論 成功構(gòu)建了小鼠真核表達載體pEGFP-C3-FNDC5，過表達FNDC5可以增強線粒體能量代謝。

FNDC5基因； 真核表達載體； 質(zhì)粒構(gòu)建； 線粒體； 能量； 小鼠

含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5)是一個由FNDC5基因編碼的，由1個單一的肽段、2個纖連蛋白區(qū)域和1個疏水的區(qū)域組成的跨膜的、C末端可以剪切修飾的蛋白[1]。FNDC5的1個剪切分泌體，鳶尾素(Irisin)最初被發(fā)現(xiàn)在運動中被剪切下釋放到血流中，驅(qū)動褐色脂肪細胞形成，抵御肥胖和糖尿病等疾病[1]。研究提示鳶尾素和肥胖、糖尿病、胰島素抵抗的發(fā)生相關(guān)[2-5]。運動、寒顫反應(yīng)等也可以產(chǎn)生鳶尾素[4-5]。由于鳶尾素的存在目前尚存在爭議[6]，本研究更關(guān)注FNDC5基因。FNDC5不僅僅存在于骨骼肌，心肌、腦和脊髓也是它最豐富表達的器官之一[2]。骨骼肌和心肌是產(chǎn)生鳶尾素的最主要的臟器之一[7-8]，鳶尾素可以增強骨骼肌細胞的能量代謝[9]，但過表達FNDC5是否可以增強肌細胞的能量代謝尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試劑

PMDT19載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq酶購自日本TaKaRa公司，pEGFP-C3載體和TOP10感受態(tài)大腸桿菌由上海大學(xué)再生與衰老實驗室提供，RNA抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司，引物由上海生工公司合成，測序分析由上海睿迪公司完成。

1.2 引物設(shè)計

在NCBI 中找到小鼠FNDC5基因(Gene ID: 384061)的CDS序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物: 5′-AAGCTTATACACC-CCGGGTCGCCGA-3′(含Hind 3酶切位點，劃線部分為酶切位點)，下游引物: 5′-GAATTCTCATAT-CTTGCTGCGGAGAAGCC-3′(含EcoR 1酶切位點，劃線部分為酶切位點)。

1.3 小鼠FNDC5基因的擴增與純化

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用QIAGEN試劑盒提取小鼠腓腸肌與心臟的總RNA，利用TaKaRa Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)體系 超純水34μl，10×buffer 5μl，MgSO42μl，引物各1μl，cDNA 1μl，dNTP 5μl，Taq酶1μl。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，63℃退火30s，68℃延伸60s，共35個循環(huán)，68℃延伸10min。

1.3.3 產(chǎn)物的鑒定與回收 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過條帶所在位置表示的大小判斷目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化相應(yīng)大小的條帶。

1.4 克隆載體PMDT-FNDC5的構(gòu)建及其鑒定

將凝膠回收的產(chǎn)物經(jīng)過加A反應(yīng)(目的片段30μl，超純水13μl，10×buffer 5μl，rTaq 1μl，dNTP 1μl，反應(yīng)體系: 72℃延伸30min)后，用PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化。將所得產(chǎn)物和PMDT19載體16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物PMDT-FNDC5轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，進氨芐(Amp+)抗性篩選，隨機挑選能夠生長出來的菌落抽提質(zhì)粒進行PCR，雙酶切鑒定(Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ)及送測序公司測序。

1.5 真核表達載體pEGFP-C3-FNDC5的構(gòu)建與鑒定

小量提取pEGFP-C3空質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定，凝膠回收純化，得到pEGFP-C3雙粘性末端質(zhì)粒。再用Hind Ⅲ 和EcoR Ⅰ雙酶切驗證正確的PMDT-FNDC5質(zhì)粒，回收純化目的片段FNDC5的雙粘性末端的片段。將回收純化的目的片段與雙粘性質(zhì)粒pEGFP-C3質(zhì)粒用T4連接酶連接。轉(zhuǎn)化后，卡那霉素篩選出能夠生長轉(zhuǎn)化子，隨機選取進行PCR，測序驗證。

1.6 熒光定量PCR檢測

轉(zhuǎn)染構(gòu)建的質(zhì)粒48h后，進行熒光定量PCR檢測。采用miRNeasy Mini Kit(德國凱杰)進行總RNA的提取，按下列組分配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(配制過程均在冰上完成): 5×reverse transcriptase mix 2μl， RNA 樣本400ng，補足去核糖核酸酶水至10μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件如下: 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃持續(xù)。實時熒光定量PCR反應(yīng): SYBR?Green 10μl，PCR正向引物(10μmol/L)1μl，PCR反向引物(10μmol/L)1μl，cDNA模板2μl和去核糖核酸酶水6μl。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3min；95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40個循環(huán)，以TBP為內(nèi)參。

引物序列如下。m-FNDC5-上游引物: 5′-TTGCCATCTCTCAGCAGAAGA-3′; m-FNDC5-下游引物: 5′-GGCCTGCACATGGACGATA-3′; m-PGC-1β-上游引物: 5′-TCCTGTAAAAGCCCGG-AGTAT-3′; m-PGC-1β-下游引物: 5′-GCTCTGGT-AGGGGCAGTGA-3′; m-ND1-上游引物: 5′-CTCA-ACCTAGCAGAAACAAACC-3′; m-ND1-下游引物: 5′-GGCCGGCTGCGTATTCTAC-3′; m-ND6-上游引物: 5′-TTGGGAGATTGGTTGATGTAT-3′; m-ND1-下游引物: 5′-TGCCGCTACCCCAATCC-3′; m-ATPase6-上游引物: 5′-TCGTTGTAGCCATCATT-ATATTTCCT-3′; m-ATPase6-下游引物: 5′-GAAA-GAATGGAGACGGTTGTTGA-3′;m-TBP-上游引物: 5′-AGAACAATCCAGACTAGCAGCA-3′; m-TBP-下游引物: 5′-GGGAACTTCACATCACAGCTC-3′。

1.7 線粒體含量染色

轉(zhuǎn)染構(gòu)建的質(zhì)粒48h后，向細胞培養(yǎng)液中加入線粒體紅色熒光探針-MitoRed 200nmol/L(南京凱基生物)和Hoechst(銳博生物)37℃孵育45min，封片后，用激光共聚焦顯微鏡(德國，Zeiss)采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1FNDC5基因片段的擴增

RT-PCR擴增，獲得FNDC5大小與預(yù)期大小(630bp)相符，見圖1。在腓腸肌組織和心臟組織樣本中條帶清晰，空白對照組無條帶。

2.2 重組質(zhì)粒PMDT-FNDC5的篩選鑒定

克隆載體PMDT-FNDC5以FNDC5的引物進行PCR得到產(chǎn)物的大小與預(yù)期大小完全相符，見圖2A。HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切克隆載體PMDT-FNDC5產(chǎn)物: 可見條帶位于3000bp附近的線狀質(zhì)粒和700～500bp之間的目的條帶，見圖2B。重組質(zhì)粒經(jīng)公司測序證實所得的FNDC5片段與NCBI收錄的FNDC5片段完全一致，見圖3。

圖1 FNDC5基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR products of FNDC5M: DL1000 DNA marker；1: 空白對照；2: 心臟組織中FNDC5片段；3: 空白對照4: 腓腸肌組織中FNDC5片段

圖2 重組質(zhì)粒PMDT-FNDC5的PCR產(chǎn)物電泳圖和經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切結(jié)果Fig.2 The PCR products of FNDC5 and results of vectors double digestion from recombinant plasmid PMDT-FNDC5A： 重組質(zhì)粒PMDT-FNDC5的PCR產(chǎn)物電泳圖；M: DL1000 DNA marker；1～4: PMDT-FNDC5 PCR產(chǎn)物結(jié)果；B： 重組質(zhì)粒PMDT-FNDC5經(jīng)Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切結(jié)果；0: 未被酶切的質(zhì)粒；M1: DL5000 DNA marker；M2: DL1000 DNA marker；1～6: PMDT-FNDC5被Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切

圖3 重組質(zhì)粒PMDT-FNDC5測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of recombinant plasmid PMDT-FNDC5

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-C3-FNDC5的篩選鑒定

從卡那霉素的平板上挑選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒后，克隆載體pEGFP-C3-FNDC5以FNDC5的引物進行PCR得到產(chǎn)物的大小與預(yù)期大小完全相符，見圖4。

圖4 重組質(zhì)粒pEGFP-C3-FNDC5的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 PCR products of pEGFP-C3-FNDC5M1: DL1000 DNA marker；1、2: pEGFP-C3-FNDC5 PCR產(chǎn)物結(jié)果；3、4: 陰性對照；M2: DL5000 DNA marker

重組質(zhì)粒經(jīng)公司測序證實所得的FNDC5片段與NCBI收錄的FNDC5片段完全一致，見圖5。

2.4 重組質(zhì)粒pEGFP-C3-FNDC5可以過表達FNDC5

在C2C12肌細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48h后，細胞顯示綠色熒光，見圖6。以熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5過表達組中與對照組相比，F(xiàn)NDC5被顯著上調(diào)(1.02±0.0860vs4208.6±20.08,P<0.01)。

2.5 過表達FNDC5可以增加線粒體含量

轉(zhuǎn)染過表達載體或者對照載體至C2C12肌細胞，48h后以激光共聚焦顯微鏡拍攝線粒體熒光強度，發(fā)現(xiàn)過表達FNDC5可以顯著增強線粒體熒光強度，見圖7。與對照組相比，F(xiàn)NDC5過表達組C2C12肌細胞中線粒體熒光強度顯著增強(5.965±0.0032vs17.59±1.03，P<0.01)。

2.6 過表達FNDC5可以增強線粒體能量代謝相關(guān)基因的表達

轉(zhuǎn)染過表達載體或者對照載體至C2C12肌細胞，48h后提取總RNA，以熒光定量PCR檢測與線粒體能量代謝相關(guān)的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表達情況，發(fā)現(xiàn)過表達FNDC5可以顯著增加線粒體能量代謝相關(guān)的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表達，見圖8。

圖5 重組質(zhì)粒pEGFP-C3-FNDC5測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5

圖6 重組質(zhì)粒pEGFP-C3-FNDC5可以過表達FNDC5Fig.6 The recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5 can induce FNDC5 overexpressionA： 對照組；B： FNDC5過表達組

圖7 過表達FNDC5可以增加線粒體含量Fig.7 The over-expressed FNDC5 can increase the content of mitochondrialA： 對照組；B： FNDC5過表達組；標(biāo)尺長度: 10μm；紅色熒光代表線粒體，藍色熒光代表細胞核

圖8 過表達FNDC5可以增強線粒體能量代謝相關(guān)基因的表達Fig.8 Over-expression FNDC5 enhances the expression of mitochondrial energy metabolism-related genes與對照組相比，*P<0.05

3 結(jié) 論

FNDC5最早于2002年由兩個不同的課題組發(fā)現(xiàn)，一個是基于對于含Ⅲ型纖連蛋白域蛋白的基因組掃描所發(fā)現(xiàn)[10]，而另外一個是基于掃描過氧化物酶蛋白的掃描所發(fā)現(xiàn)[11]。但是，F(xiàn)NDC5的功能研究長期為人們所忽視。

鳶尾素的研究目前在學(xué)界充滿著爭議，一方學(xué)者認為運動可以增加循環(huán)鳶尾素的表達，且鳶尾素可以促進脂肪細胞褐色化，可以治療肥胖和糖尿病[1]。同時，鳶尾素可以激活大腦中的神經(jīng)保護因子，如BDNF等，可能具有潛在的治療阿爾茨海默病的作用[6]。但是，另一方學(xué)者卻認為，所有的現(xiàn)在使用的檢測鳶尾素的ELISA試劑盒并沒有經(jīng)過驗證，事實上，鳶尾素并不存在[7]。

無論鳶尾素存在與否，F(xiàn)NDC5的功能研究尚屬于相對空白。FNDC5在肌肉組織、心臟組織和腦組織中具有很高的表達水平。運動訓(xùn)練可以使得肌肉和腦組織中的FNDC5表達增加，F(xiàn)NDC5的單核苷酸多態(tài)性與骨骼肌細胞的糖代謝調(diào)控相關(guān)[7,12]。過表達FNDC5可以促進小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化[13]，也有研究證實FNDC5有促進胚胎干細胞向神經(jīng)元分化的作用[14]。鳶尾素被報道可以增強骨骼肌細胞的能量代謝[9]，但是過表達FNDC5是否可以增強肌細胞的能量代謝尚不清楚。本研究初步提示過表達FNDC5可以增強肌細胞的能量代謝，主要體現(xiàn)在線粒體含量的增加以及與線粒體能量代謝相關(guān)的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表達的增加。

本研究成功構(gòu)建了pEGFP-C3-FNDC5表達載體，并初步提示過表達FNDC5可以增強線粒體能量代謝，為下一步深入探索FNDC5在肌細胞中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Construction and preliminary functional studies of Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5 eukaryotic expression vector

WEIFei-yu1,CHENGYan2,LIJin3,XIAOJun-jie3,ZHOULei1

(1. Dept. of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China; 2. Dept. of Psychiatry, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China；3. School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Objective To construct eukaryotic expression vector pEGFP-C3-FNDC5 and to investilate its role in regulating mitochondrial biogenesis in C2C12 myocytes. Methods The cDNA coding sequence ofFNDC5 containing digest siteHindⅢ andEcoRⅠ was amplified by RT-PCR from gastrocnemius muscle and heart tissue of mice, and was then inserted into PMD19-T vector and pEGFP-C3 vector. The recombined plasmid was identified by PCR and further sequenced. After transfection of vector for 48h, mitochondrial content was measured by confocal microscopy and genes regulating mitochondrial biogenesis was determined by quantitative Real-Time polymerase chain reaction(qRT-PCR). Results PCR and DNA sequencing results showed that the recombinant plasmid pEGFP-C3-FNDC5 contained the fragment ofFNDC5.FNDC5 overexpression enhanced mitochondrial content and also increased the expression of PGC-1β, ATPase6, ND1 and ND6. Conclusion The eukaryotic expression vector pEGFP-C3-FNDC5 has been constructed successfully.FNDC5 overexpre-ssion can enhance mitochondrial biogenesis.

FNDC5 gene; eukaryotic expression vector; vector construct; mitochondrial; energy; mice

10.16118/j.1008-0392.2015.04.004

2015-03-17

國家自然基金青年項目(81400885)

魏飛宇(1988—),男，碩士研究生.E-mail: nanjingweifeiyu@163.com

周 蕾.E-mail: nanjingzhoulei@163.com

R 3

A

1008-0392(2015)04-0019-06