陳 曉， 周 薇， 王方策， 王 龍， 蔣 濤， 趙培林

(同濟大學醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，上海 200092)

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·基礎研究·

DC-OVA疫苗在裸鼠體內的抗腫瘤效應

陳 曉， 周 薇， 王方策， 王 龍， 蔣 濤， 趙培林

(同濟大學醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，上海 200092)

目的 構建靶向樹突狀細胞(dendritic cell, DC)的腫瘤疫苗DC-OVA系統(tǒng)，探討DC-OVA腫瘤疫苗在祼鼠體內的抗腫瘤效應及相關機制。方法 構建表達腫瘤抗原OVA的樹突狀細胞。建立攜帶OVA的Lewis肺癌細胞(Lewis lung cancer cell-OVA， LLC-OVA)的皮下荷瘤裸鼠模型，瘤旁注射DC-OVA疫苗，通過記錄腫瘤大小觀察腫瘤生長抑制狀況。以IHC方法觀察腫瘤組織CD3、Nestin、CD133陽性細胞；觀察脾DC相關分子(CD11c、OVA)的陽性表達以及T細胞(CD3+)的分布、數(shù)量和功能變化。同時，應用ELISA方法檢測血清中IL-12的表達水平。結果 DC-OVA疫苗預防組與PBS對照組比較，呈現(xiàn)出明顯的腫瘤生長抑制(P<0.05)。與對照組相比,DC-OVA疫苗治療組腫瘤明顯縮小(P<0.001)。疫苗治療3次組與治療1次組比較，效果更明顯(P<0.05)。于實驗第4周，疫苗治療1次組與對照組比較，CD3陽性表達高，Nestin、CD133陽性表達低(P<0.05)；治療1次組血清IL-12含量較對照組升高(P<0.001)；第8周，治療1次組血清IL-12含量較第4周治療組及第8周對照組低。結論 DC-OVA疫苗特異性殺傷了LLC-OVA腫瘤細胞，使腫瘤干細胞表達Nestin、CD133減少。

樹突狀細胞； 肺腫瘤細胞； DC疫苗； 腫瘤免疫治療; 祼鼠

目前，肺癌在全球癌癥死亡率中排在首位，每年新增約130萬病例，且多數(shù)患者就診時病變已不可切除[1]。近年來，以樹突狀細胞(dendritic cell, DC)為基礎的腫瘤疫苗介導的抗腫瘤免疫應答成為腫瘤治療研究的熱點。DC是體內最重要、功能最強，也是唯一能激活初始T細胞的抗原提呈細胞，可攝取、處理和呈遞抗原，啟動和調控免疫反應[2]。DC已成為腫瘤免疫治療策略中倍受關注的靶點。腫瘤患者體內免疫功能低下，DC抗原提呈功能缺陷、腫瘤細胞免疫原性減弱，不能有效激活T細胞，是腫瘤免疫逃逸的主要原因[3]。如何有效地激活T細胞而殺傷腫瘤細胞成為免疫治療的關鍵。本課題組前期工作已初步表明所構建的靶向DC的基因工程疫苗對肺癌細胞的體外殺傷效應[4]。本研究通過構建DC-OVA腫瘤疫苗系統(tǒng)，進一步探討DC-OVA腫瘤疫苗在體內的抗腫瘤效應，為肺癌免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質粒與細胞

pHR-CMV-EGFP-OVA為基因轉移質粒，pLTR-VSVG為胞膜質粒，pHIV-packaging為包裝質粒，均由本實驗室構建、保存；LLC-OVA由本實驗室構建、保存。

1.2 實驗動物

SPF級6～8周雄性BALB/c裸鼠、雄性BALB/c小鼠，購于上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于同濟大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑

去內毒素質粒大提試劑盒購自北京天根公司；LiPofactAMINE 2000購自美國Invitrogen公司；細胞因子購自英國Peprotech公司；小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、小鼠IL-4、培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；PE標記倉鼠抗小鼠CD11c、倉鼠抗小鼠CD11c購自美國BD公司；兔抗小鼠CD3、CD8、Nestin購自武漢博士德生物公司；兔抗小鼠CD133購自美國Proteintech公司；兔抗雞OVA購自美國Abcam公司；IL-12 ELISA試劑盒購自美國RayBio公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

293T細胞和LLC-OVA細胞復蘇后分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液和RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入雙抗(100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)，置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，每2～3d傳代1次。

1.5 質粒擴增、提取與鑒定

用去內毒素質粒提取試劑提取純化質粒，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。具體方法詳見文獻[4]。

1.6 慢病毒的包裝

三質粒以脂質體法共轉染293T細胞，具體方法詳見文獻[4]。

1.7 小鼠骨髓DC(bone marrow dendritic cell, BMDC)的分離純化與分析鑒定

取小鼠股骨與脛骨，將骨髓從骨髓腔內沖洗出來，吹打成單細胞懸液，行紅細胞裂解。用含有25ng/ml GM-CSF和4ng/ml IL-4的RPMI培養(yǎng)液懸浮細胞，調整濃度為1×106個/ml，接種于6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。3d后半量換液。收集第6天骨髓細胞經(jīng)PE標記的CD11c抗體孵育后，進行流式細胞分析；同時將部分細胞接種于圓形玻片上培養(yǎng)，而后進行CD11c的免疫組織化學染色(immunocytochemistry, ICC)染色。

1.8 慢病毒顆粒轉導BMDC細胞

把收集的DC轉移到圓底離心管中，添加含有8μg/ml 聚凝胺的病毒上清液至DC懸浮液中，小心混合，離心半徑16.5cm，3000r/min，離心4h，保留部分含病毒液體，并隨細胞一道轉移至培養(yǎng)皿中，孵育過夜，換新鮮RPMI培養(yǎng)液，并補充細胞因子。

1.9 尼龍毛柱分離純化T細胞

將1g尼龍毛柱填入10ml沒有活塞的注射器中制備尼龍毛柱，高壓蒸汽滅菌。取小鼠脾，研磨脾細胞，收集細胞并過濾。行紅細胞裂解，離心洗、計數(shù)，將制備好的細胞置于尼龍毛柱上，37℃孵育45min，而后緩慢連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)液，并收集前15ml濾液。細胞經(jīng)離心洗并計數(shù)后用于后續(xù)實驗。

1.10 DC-OVA和T細胞共培養(yǎng)

經(jīng)OVA轉導過的DC與T細胞以1∶4的比例混合，用含有25ng/ml GM-CSF、4ng/ml IL-4、4ng/ml IL-2的RPMI-10培養(yǎng)，共孵育72h，制備DC-OVA腫瘤疫苗系統(tǒng)。

1.11 荷瘤小鼠模型的建立與實驗分組

所有受試裸鼠共18只，每只裸鼠軀干部皮下注射7×106/200μl LLC-OVA，建立荷瘤小鼠模型。實驗分為對照組、治療1次組、治療3次組、預防組。對照組共6只裸鼠，腫瘤細胞接種1周后行PBS注射，分別于腫瘤細胞接種后第4、8周取材，每組3只。治療1次組共6只裸鼠，于腫瘤細胞接種1周后注射1×107/200μl DC-OVA疫苗，分別于腫瘤細胞接種后第4、第8周取材，每組3只；治療3次組共3只裸鼠，腫瘤細胞接種后1周開始注射上述劑量的疫苗，每隔1周注射1次，腫瘤細胞接種后第8周取材；預防組共3只裸鼠，腫瘤細胞接種前1周注射1×107/200μl DC-OVA疫苗，即腫瘤細胞接種3周后取材。

每天觀察腫瘤生長情況，用游標卡尺測量記錄腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積(V):V=ab2/2。根據(jù)腫瘤體積變化繪制腫瘤生長曲線。

1.12 脾臟、腫瘤形態(tài)學觀察與功能檢測

將所取腫瘤組織、脾進行石蠟切片，采用IHC檢測觀察脾中CD3、CD11c、OVA，腫瘤內CD3、Nestin、CD133的表達。常規(guī)烤片，脫蠟，3%H2O2封閉10min,一抗4℃孵育過夜，滴加生物素化二抗室溫孵育1h,DAB顯色，蘇木精復染，脫水、封片。顯微鏡下觀察CD3、CD133、Nestin染色切片，其陽性表達均呈現(xiàn)棕黃色。每張切片在低倍(×100)顯微鏡下，選取5個有代表性且不重復的區(qū)域，兩人在高倍(×400)顯微鏡下雙盲計數(shù)(誤差超過10%則重復計數(shù))。每個視野細胞陽性率=每個視野陽性細胞數(shù)/每個視野細胞總數(shù)×100%。

1.13 血清中IL-12

在反應板內分別加入標準品或血清樣本100μl，將其充分搖勻后室溫靜置2.5h。用漂洗液將反應孔重復漂洗6次，濾紙吸干。每孔各加入一抗100μl，混勻后置室溫1h。每孔加入底物工作液100μl，置37℃避光反應45min。終止反應后30min內用酶標儀在450nm處測吸光度值(D450)，獲得標準曲線和樣品中IL-12濃度。

1.14 統(tǒng)計學處理

采用PRISM 5.0和Adobe Illustrator CC軟件繪制圖表。應用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，腫瘤體積、血清IL-12含量用方差分析，陽性率的比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 BMDC分離純化及慢病毒質粒轉導DC效率的檢測

分離、培養(yǎng)及初步純化后第6天收集骨髓細胞，通過CD11c抗體孵育，F(xiàn)ACS分析，從中分選出CD11c陽性細胞，陽性率為56.60%。ICC染色后，觀察到骨髓細胞中CD11c陽性細胞占骨髓細胞總數(shù)的50%～60%，陽性反應產(chǎn)物位于細胞胞質，呈較均勻棕黃色，見圖1。重組慢病毒質粒轉導DC 48h后，在熒光顯微鏡下可見大量的DC呈綠色熒光，轉導效率達70%以上，見圖2。

很多父母強烈希望自己的孩子像某些文化標簽下的“好孩子”，但事實上，一味盲從榜樣的方法會帶來很大的麻煩。

圖1 CD11c在BMDC的表達Fig.1 Expression of CD11c in BMDC(ICC，×400)

圖2 OVA慢病毒質粒轉導DC的觀察Fig.2 Transduction of DC by OVA lentiviral plasmid(×400)A： 熒光顯微鏡圖像；B： 同一視野相差顯微鏡圖像

2.2 DC-OVA疫苗對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

對照組腫瘤生長較快，DC-OVA疫苗治療組腫瘤生長抑制明顯，腫瘤最終消失，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(F=44.475,P<0.001)。治療3次組較治療1次組腫瘤抑制更明顯，腫瘤生長慢，消失快(P=0.035<0.05)，其生長曲線見圖3。DC-OVA疫苗預防組較PBS對照組腫瘤生長慢，腫瘤生長明顯受抑制，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(F=17.329,P=0.009<0.05)，腫瘤生長曲線見圖4；腫瘤細胞注射后，裸鼠腫瘤生長狀況的大體觀察見圖5。

2.3 脾組織病理學觀察

在脾的動脈周圍淋巴鞘及邊緣區(qū)，CD3、CD11c均有表達，陽性產(chǎn)物定位于細胞質。CD3陽性染色呈棕褐色、著色均勻，見圖6。第4周時，DC-OVA疫苗治療1次組CD3陽性率(15.00%±2.29%)較對照組(9.04%±2.06%)高，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.68,P=0.002<0.05)；

CD11c陽性染色呈現(xiàn)為較強的不均勻的棕黃色，細胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一。OVA陽性細胞胞質呈棕黃色，其分布區(qū)域與CD11c大致相同，見圖7。

圖3 治療性實驗腫瘤生長曲線Fig.3 Growth curve of the tumor in vaccine treatment groups

圖4 預防性實驗腫瘤生長曲線Fig.4 Growth curve of the tumor in vaccine preventiion group

圖5 裸鼠腫瘤生長的大體觀察Fig.5 Gross observation of the tumor growth in nude miceA： 對照組(第3周)；B： DC-OVA疫苗預防組(第3周)；C： 對照組(第4周)；D： DC-OVA疫苗治療1次組(第4周)；E： 對照組(第8周)；F： DC-OVA疫苗治療1次組(第8周)；G： DC-OVA疫苗治療3次組(第8周)

圖6 CD3在脾中的表達Fig.6 Expression of CD3 in spleen(IHC，×400)A： DC-OVA疫苗治療1次組；B： PBS對照組

圖7 CD11c、OVA在脾中的表達Fig.7 Expression of CD11c and OVA in spleen(IHC，×400)A： CD11c; B: OVA

2.4 腫瘤組織病理學觀察

顯微鏡下可見腫瘤灶邊緣有淋巴細胞浸潤，亦見散在分布于腫瘤組織內，CD3陽性染色主要定位于淋巴細胞胞質中，呈均勻棕褐色。CD133陽性表達在細胞質中呈棕黃色沉淀，胞核不著色，細胞形態(tài)不規(guī)則，大小基本一致，大部分陽性細胞散在于腫瘤組織邊緣，不甚均勻，見圖8。Nestin染色較強，在胞質呈棕黃色顆粒、分布均勻，細胞形態(tài)不規(guī)則，大小一致，見圖9。CD133、Nestin在所有腫瘤標本均有表達，第4周時，對照組CD133、Nestin陽性表達率(20.21%±8.69%、21.59%±3.84%)較DC-OVA疫苗治療1次組(9.93%±1.86%、11.74%±2.95%)高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.58,P=0.03<0.05;t=4.54,P=0.002<0.05)。

圖8 CD3、CD133在腫瘤組織中的表達Fig.8 Expression of CD3 and CD133 in tumor tissus(IHC，×400)A： CD3；B： CD133

圖9 Nestin在腫瘤組織中的表達Fig.9 Expression of Nestin in tumor tissus(IHC,×400)A： DC-OVA疫苗治療1次組；B： 對照組

2.5 血清IL-12含量檢測

第4周時，DC-OVA疫苗治療1次組IL-12水平為(105.85±4.0)pg/ml，明顯高于對照組(37.91±1.90)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(F=244.4,P<0.001)。第8周時疫苗治療1次組IL-12的水平為(43.71±4.50)pg/ml，明顯低于對照組(87.41±4.35)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。治療1次組第4周IL-12的水平較第8周時高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

3 討 論

DC的數(shù)量、相關的生物活性、抗原提呈并激活特異性T細胞的能力是靶向DC腫瘤免疫治療的幾個重要環(huán)節(jié)[5]。本研究中，經(jīng)DC-OVA疫苗治療，腫瘤生長速度明顯減緩，腫瘤體積減小，甚至最后消失。預防組腫瘤出現(xiàn)遲、發(fā)展慢。這些結果表明，本實驗所構建的DC-OVA疫苗在裸鼠體內保持了良好的生物免疫活性及足夠的DC數(shù)量；不僅具有抑制、殺傷腫瘤的作用，而且具有阻止腫瘤發(fā)生的作用。進一步的結果顯示，疫苗治療3次組較治療1次組效果更為明顯，并且治療3次組在40d左右腫瘤完全消失，提示DC-OVA疫苗與抗腫瘤免疫反應之間有著直接的量效關系。

在靶向DC的腫瘤免疫治療中，DC的歸巢顯得尤為重要。由于T細胞主要居于周圍淋巴器官的胸腺依賴區(qū)，DC只有遷移歸巢至周圍淋巴器官才能與T細胞形成免疫接觸，激發(fā)免疫應答。有研究[6]表明，影響以DC為基礎的腫瘤免疫治療療效的重要因素是體外回輸?shù)耐庠葱訢C歸巢的能力和數(shù)量。免疫組織化學染色顯示裸鼠脾臟中DC-OVA細胞的存在，主要分布于動脈周圍淋巴鞘及邊緣區(qū)，即T細胞所在區(qū)域。由此表明，瘤體周圍注射的DC-OVA在裸鼠體內存活并遷移歸巢，繼而DC-OVA才有可能刺激T細胞使之活化為CTL，并最終殺傷LLC-OVA肺癌細胞，抑制裸鼠皮下瘤的生長。T細胞標記分子CD3的實驗顯示，第4周時,DC-OVA疫苗治療1次組脾組織中CD3陽性細胞明顯增多，這反映了在體外經(jīng)OVA抗原活化的T細胞經(jīng)瘤旁注射后歸巢至脾，并在脾內增殖，進而產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應。第8周時DC-OVA疫苗治療組CD3的陽性表達與治療次數(shù)之間無明顯差別；且DC-OVA疫苗治療組CD3的陽性表達低于對照組。產(chǎn)生這兩個結果可能的原因: 治療多次的優(yōu)勢可能更多體現(xiàn)在時間效應上而非強度效應；治療末期，治療組腫瘤逐漸消失，導致T細胞數(shù)量縮減，而對照組腫瘤體積依然增大，裸鼠體內產(chǎn)生一定的免疫反應，一定的數(shù)量T細胞亦可增殖，然而這些T細胞可能為非特異性的或功能缺陷型的，并無明顯的抗腫瘤效應。

腫瘤干細胞理論認為腫瘤干細胞是導致腫瘤細胞不同分化程度和促使腫瘤不斷生長和復發(fā)的根源。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞標志物Nestin、CD133在肺癌[7]、胰腺癌[8]、卵巢癌[9]、神經(jīng)膠質瘤[10]等表達；Nestin和CD133的表達強度與腫瘤惡性程度和預后具有相關性[8-10]。本研究顯示，CD133、Nestin在LLC-OVA細胞形成的腫瘤組織中均有表達。第4周時DC-OVA疫苗治療1次組CD133和Nestin表達量明顯低于對照組，提示DC-OVA疫苗激活的效應性T細胞不僅特異性殺傷了LLC-OVA腫瘤細胞且有效地殺傷了CD133和Nestin標志的腫瘤干細胞，因而更有效地抑制了腫瘤的生長。提示DC-OVA疫苗除治療作用外，還有可能降低腫瘤的惡性程度，降低復發(fā)率，提示預后較好。

IL-12主要由DC等抗原提呈細胞分泌產(chǎn)生，在原發(fā)性、自發(fā)性腫瘤的免疫中均發(fā)揮重要作用，其機制主要是通過促進T細胞增殖和誘導T細胞殺傷活性，調節(jié)T細胞介導細胞免疫發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究檢測裸鼠血清中IL-12含量，發(fā)現(xiàn)第4周時DC-OVA疫苗治療1次組IL-12的水平明顯高于對照組；腫瘤生長曲線可見在第4周時腫瘤開始縮小，表明在抗腫瘤過程中，DC-OVA大量分泌IL-12誘導免疫反應。第8周時疫苗治療1次組IL-12的水平明顯低于第4周治療組和第8周對照組，表明隨著腫瘤的逐漸消退DC-OVA功能逐漸下降，分泌的IL-12也隨之減少，趨于恢復至常態(tài)。

綜上所述，DC-OVA疫苗特異性地殺傷了LLC-OVA腫瘤細胞，且有效地殺傷了其中的腫瘤干細胞，在體內具有強大的抗腫瘤效應，包括腫瘤治療及預防性作用，并且有可能降低腫瘤復發(fā)風險。

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Anti-tumor effect of DC-OVA vaccine in nude mice

CHENXiao,ZHOUWei,WANGFang-ce,WANGLong,JIANGTao,ZHAOPei-lin

(Dept. of Histology & Embryology, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To prepare DC-OVA vaccine system and to investigate its anti-tumor effect in Lewis lung cancer bearing nude mice. Methods Ovalalbumin(OVA) plasmid was transfected into dendritic cells(DC) to construct DC-OVA and cytotoxic T cells were activated by DC-OVA. The DC-OVA vaccine system was prepared. Lewis lung cancer cells+OVA were inoculated in nude mice, and the tumor-bearing(LLC-OVA) nude mice were treated with DC-OVA. The tumor growth was measured by vernier caliper; the expression of CD11c, OVA and CD3 in mice spleen, the expression of CD3, Nestin and CD133 in tumor tissue were detected by immunohistochemistry(IHC); serum IL-12 in nude mice was measured by ELISA. Results Compared with control group, vaccine prevention group presented significant inhibition effect on tumor growth(P<0.05). Compared with control group the tumor size was significantly smaller in vaccine treatment group(P<0.001). The tumor-inhibition effect in nude mice with 3-time treatment was more marked than that with one-time treatment(P<0.05). In week 4 compared with control group, the expression of CD3 in vaccine treatment group was higher and expression of Nestin and CD133 was lower(P<0.05). The serum IL-12 in vaccine treatment group was significantly increased(P<0.001) at week 4; however, serum IL-12 in treatment group at week 8 was lower than that in treatment group at week 4 and control group at week 8(bothP<0.001). Conclusion DC-OVA vaccine system can prevent and treat tumor-bearing nude mice, and it is effective in inhibiting tumor stem cells expressing Nestin and CD133.

dendritic cells; lung cancer cell; DC vaccine; tumor immunotherapy; nude mice

10.16118/j.1008-0392.2015.04.001

2015-01-22

上海市教委科研創(chuàng)新重點項目(08ZZ19)

陳 曉(1987—)，女，碩士研究生.E-mail: 448346726@qq.com

趙培林.E-mail: plzhao@yahoo.com

R 73

A

1008-0392(2015)04-0001-06