周 靜， 邱 鵬， 邢 準(zhǔn)， 董有靜

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110004)

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·基礎(chǔ)研究·

七氟烷對卵白蛋白致敏的高反應(yīng)氣道平滑肌cAMP的影響

周 靜， 邱 鵬， 邢 準(zhǔn)， 董有靜

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110004)

目的 觀察七氟烷對卵白蛋白致敏的豚鼠的高反應(yīng)氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的影響。方法 40只雄性豚鼠隨機(jī)分為5組: 正常組、致敏組、致敏對照組、致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷組，每組8只。應(yīng)用卵白蛋白和測量肺阻力變化曲線建立并評價(jià)豚鼠的致敏氣道模型。檢測致敏豚鼠氣道平滑肌細(xì)胞cAMP的表達(dá)，評價(jià)不同濃度七氟烷對高反應(yīng)致敏氣道的擴(kuò)張作用。結(jié)果 與正常組相比，致敏組能顯著升高豚鼠的肺阻力變化曲線；與致敏對照組相比，致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷組的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)明顯增高。結(jié)論 七氟烷能夠增加卵白蛋致敏的豚鼠的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)，提示七氟烷可以通過提高高反應(yīng)致敏氣道平滑肌cAMP的表達(dá)發(fā)揮擴(kuò)張作用。

七氟烷； 環(huán)磷酸腺苷； 氣道平滑??； 高反應(yīng)氣道； 豚鼠

氣道高反應(yīng)性是指氣道的過度反應(yīng)狀態(tài)，通常是氣道受到變應(yīng)原或其他刺激后，由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的參與、氣道上皮和上皮內(nèi)神經(jīng)的損害等導(dǎo)致，表現(xiàn)出敏感而過強(qiáng)的支氣管平滑肌收縮反應(yīng)，引起氣道狹窄，氣道阻力增加和相應(yīng)的肺順應(yīng)性下降，從而引發(fā)咳嗽、胸悶、呼吸困難和喘息等癥狀，是圍手術(shù)期常見的病理生理反應(yīng)[1]。近年來，由于氣道炎癥、病毒感染、SO2、冷空氣、干燥空氣等理化刺激，使得具有氣道高反應(yīng)性的患者，在全球范圍內(nèi)迅速增長，隨之而來的是呼吸道疾病(如支氣管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等)的高發(fā)病率。目前，針對高反應(yīng)氣道患者的圍術(shù)期管理已經(jīng)成為的臨床麻醉領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)問題，其有效措施主要著眼于使用預(yù)防氣道收縮和應(yīng)用具有潛在氣管擴(kuò)張效果的藥物。而在眾多麻醉藥物的選擇中，吸入性麻醉藥通常被視為一線藥物用于氣道高反應(yīng)患者的麻醉維持[2]。

七氟烷是新興的一種高效含氟吸入麻醉藥。對熱和強(qiáng)酸穩(wěn)定，無刺激性氣味，最小肺泡有效濃度(MAC)在純氧中為1.7%，蘇醒迅速，麻醉深度易調(diào)節(jié)。在臨床全身吸入麻醉實(shí)施中，七氟烷的優(yōu)勢在于誘導(dǎo)和蘇醒較現(xiàn)有的強(qiáng)效麻醉藥快，有良好的作用。副作用方面，七氟烷對心血管影響比異氟烷小，心律失常少見，與腎上腺素合用無妨；隨麻醉加深呼吸抑制加重，但較氟烷輕；對腦血流量、顱內(nèi)壓影響與異氟烷相似，未見明顯的肝損害。故七氟烷具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，特別是對小兒和老年患者。然而，針對具有高反應(yīng)氣道的患者，七氟烷是否具有保護(hù)作用，其作用效果和作用機(jī)制目前尚不明確，仍存在爭議[3]。本課題組既往研究顯示，七氟烷可以通過降低致敏氣道的肺阻力和氣道平滑肌的張力發(fā)揮擴(kuò)張作用，為進(jìn)一步深入明確其作用機(jī)制，本研究擬用卵白蛋白致敏的豚鼠模型，測量七氟烷干預(yù)的卵白蛋白致敏的離體氣道平滑肌環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的表達(dá)，揭示七氟烷對致敏高反應(yīng)氣道的作用效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

5周齡雄性豚鼠，體質(zhì)量300～350g，札幌醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供(倫理編號08-023)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為: 正常組、致敏組、致敏對照組、致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷組，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

七氟烷、卵白蛋白、乙酰膽堿等試劑均購于日本Sigma公司。氣道、食道測壓裝置(DP-45)購于美國Validyne Engineering公司，壓力轉(zhuǎn)換器(Plumos-Ⅱ)購于日本Medical Interface Project Station公司，cAMP試劑盒購于美國Biovision公司。

1.3 方法

1.3.1 致敏氣道模型建立 根據(jù)McCaig等[4]致敏氣道模型的經(jīng)典制備方法，制備致敏豚鼠。方法簡述如下: 向豚鼠腹腔內(nèi)注射1mg卵白蛋白，10d后霧化吸入卵白蛋白，每次劑量1mg，持續(xù)10min，每日1次，連續(xù)3d。正常組的豚鼠，采用生理鹽水代替卵白蛋白進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入。

1.3.2 肺阻力的測定 霧化吸入結(jié)束后的次日，腹腔內(nèi)注射烏拉坦1.5g/kg。行氣管插管，容量控制呼吸，呼吸頻率為32 次/min，潮氣量為(6～8)ml/kg，根據(jù)呼吸末CO2(維持在40mmHg左右，1mmHg=0.133kPa)，調(diào)整潮氣量。開放右中心靜脈，置管，連續(xù)給予羅庫溴銨2mg/(kg·h),以消除自主呼吸。經(jīng)口腔置測壓管到食道中下1/3。應(yīng)用氣道、食道測壓裝置和壓力轉(zhuǎn)換器，連續(xù)測量瞬時(shí)肺阻力。

1.3.3 致敏氣道模型評價(jià) 正常組與致敏組豚鼠中，肺阻力值達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，靜脈連續(xù)給予乙酰膽堿，劑量由1～6μg/kg，間隔時(shí)間為5min，每次劑量增加1μg/kg。根據(jù)肺阻力對不同劑量乙酰膽堿的峰反應(yīng)值，得到肺阻力的劑量反應(yīng)曲線，評價(jià)致敏氣道模型。

1.3.4 氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP表達(dá)的測定 致敏對照組、致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷3組豚鼠中，肺阻力值達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，分別吸入0、2%(豚鼠的1個(gè)最低肺泡有效濃度)、4%的七氟烷20min。放血法處死豚鼠后，取氣管環(huán)連接處的整條氣道平滑肌,置于生理鹽緩沖液(136.9mmol/L NaCl, 5.4mmol/L KCl, 1.5mmol/L CaCl2, 1.0mmol/L MgCl2, 23.9mmol/L NaHCO3,5.5mmol/L葡萄糖, 37℃)，清除結(jié)締和脂肪組織后，迅速將標(biāo)本置于液氮并于-80℃冰箱保存待用。根據(jù)cAMP試劑盒的操作步驟測量氣道平滑肌標(biāo)本的cAMP的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 致敏氣道模型的肺阻力變化

對正常組與致敏組豚鼠給予不同劑量乙酰膽堿后，與正常組相比，致敏組豚鼠的肺阻力變化曲線顯著抬高。其中，當(dāng)乙酰膽堿劑量為3～6μg/kg時(shí)，兩組的峰值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)乙酰膽堿劑量分別為0、6μg/kg時(shí)，致敏組的肺阻力峰反應(yīng)值比正常組分別高18%、40%。

圖1 正常組和致敏組對不同劑量乙酰膽堿的肺阻力峰值的影響Fig.1 The peak response of lung resistance to different doses of acetylcholine in normaland sensitized groups與正常組相比，*P<0.05

2.2 七氟烷應(yīng)用后氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP表達(dá)的變化

應(yīng)用不同劑量七氟烷后，與致敏對照組[(0.52±0.15)pmol/μl]相比，致敏2%七氟烷組[(1.12±0.32)pmol/μl]和致敏4%七氟烷組[(1.32±0.25)pmol/μl]的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)的cAMP值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷組間峰值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 致敏對照組、致敏2%七氟烷組和致敏4%七氟烷組的氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)Fig.2 Intracellular cAMP levels of airway smooth muscle in sensitized control, sensitized 2% sevoflurane and sensitized 4% sevoflurane groups與致敏對照組相比，*P<0.05

3 討 論

吸入麻醉藥的氣道作用有很強(qiáng)的臨床實(shí)用價(jià)值，可直接作用于氣道平滑肌，在臨床使用濃度范圍內(nèi)發(fā)揮直接舒張氣道的效應(yīng)，有效降低氣道阻力，減輕氣道高反應(yīng)。不但用于高反應(yīng)氣道患者的圍術(shù)期管理，而且推薦用于哮喘患者的麻醉實(shí)施與治療，對于傳統(tǒng)方法治療無效的哮喘持續(xù)狀態(tài)的患者，吸入麻醉藥往往會(huì)取得良好的臨床效果。其舒張氣管平滑肌的作用主要與抑制鈣通道、降低鈣離子的濃度、抑制氣管平滑肌細(xì)胞對鈣的敏感性及促進(jìn)氣管平滑肌細(xì)胞膜超極化等有關(guān)。近年來，對吸入麻醉藥舒張氣道平滑肌的作用及機(jī)制又有了新的進(jìn)展，包括: (1) 抑制儲存鈣通道的開放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低而引起氣管平滑肌舒張[6]；(2) 增加氣道平滑肌蛋白磷酸激酶的活性，促進(jìn)肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，在細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度不變的情況下舒張氣管平滑肌，降低氣管阻力[7]；(3) 抑制Gαq/11蛋白由失活型向激活型的轉(zhuǎn)變，和氣管平滑肌收縮有關(guān)的G蛋白亞型是Gαq/11，且也是吸入麻醉藥的作用位點(diǎn)，抑制此位點(diǎn)能抑制平滑肌收縮，從而降低氣道阻力[8]。

七氟烷是現(xiàn)階段臨床廣泛應(yīng)用的吸入麻醉藥之一，其舒張氣道平滑肌的作用優(yōu)于異氟烷、氟烷。但是，七氟烷對于致敏高反應(yīng)氣道的作用仍存在爭議，雖然有臨床報(bào)道七氟烷可以增加輕、中度哮喘兒童的肺阻力[9]，但更多的研究[10-13]證實(shí)七氟烷具有氣道擴(kuò)張作用。本研究結(jié)果表明，在致敏氣道中，七氟烷可以提高氣管平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。Iwasaki等[14]曾報(bào)道七氟烷可以通過提高高反應(yīng)氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)，促使氣道平滑肌舒張。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種功能，進(jìn)而引起相關(guān)的病理生理改變。它能夠激活蛋白激酶A(PKA)，促進(jìn)PKA磷酸化相應(yīng)的功能蛋白，使肌肉收縮受阻,進(jìn)而促進(jìn)平滑肌松弛；同時(shí)，cAMP還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子外流和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對鈣離子的攝取，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，引起平滑肌舒張[15]。因此，本研究結(jié)果提示的七氟烷可以通過提高致敏氣道平滑肌細(xì)胞cAMP表達(dá)，發(fā)揮其氣道擴(kuò)張的作用，是與既往研究結(jié)果相一致的；它們共同揭示了高表達(dá)的cAMP是七氟烷降低致敏氣道肺阻力的機(jī)制之一，而與其相關(guān)的更多、更深入的研究吸入麻醉藥七氟烷對卵白蛋白致敏的高反應(yīng)氣道的擴(kuò)張作用機(jī)制有待于我們繼續(xù)探討。

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Effect of sevflurane on cAMP levels in smooth muscle cells of ovalbumin-sensitized hyperresponsiveness airway in guinea pigs

ZHOUJing,QIUPeng，XINGZhun,DONGYou-jing

(Dept. of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical Uneversity, Shenyang 110004, Liaoning Province, China)

Objective To investigate the effects of sevoflurane on cAMP levels in smooth muscle cells of ovalbumin-sensitized hyperresponsiveness airway in guinea pigs. Methods Forty male guinea pigs were randomly divided into 5 groups: normal group, sensitized group, sensitized control group, sensitized 2% sevoflurane group and sensitized 4% sevoflurane group(n=8 in each group). The lung resisitance was recorded and the dose-response curves for acetylcholine of lung resistance were used to evaluate the sensitized airway model. The intracellular cyclic adenosine monophosphate(cAMP) levels in airway smooth muscle cells were measured to evaluate the brochodilator effect of sevoflurane. Results The dose-response curves for acetylcholine of lung resistance were elevated significantly in the sensitized group compared to normal group. The intracellular cAMP levels in the airway smooth muscle cells were higher in sensitized 2% sevoflurane and sensitized 4% sevoflurane groups than those in sensitized control group. Conclusion Sevoflurane can increase the intracellular cAMP levels in airway smooth muscle cells of sensitized guinea pigs, which suggests that sevoflurane has a brochodilator effect in sensitized airways.

sevoflurane; cAMP; airway smooth muscle; hyperresponsiveness airway; guinea pigs

10.16118/j.1008-0392.2015.04.005

2015-02-01

遼寧省自然科學(xué)基金(2014021023)

周 靜(1980—)，女，講師，博士.E-mail： zhoujing200427565@163.com

R 971

A

1008-0392(2015)04-0025-04