陳龍杰， 楊 俊， 李午麗， 趙守亮

(1. 同濟大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，上海 200072；2. 同濟大學口腔生物醫(yī)學及轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室，上海 200072;3. 復旦大學附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040)

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·基礎(chǔ)研究·

硝苯地平對人牙齦成纖維細胞MMP-1和MMP-2 mRNA表達的影響

陳龍杰1，2， 楊 俊1，2， 李午麗1，2， 趙守亮1,3

(1. 同濟大學附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，上海 200072；2. 同濟大學口腔生物醫(yī)學及轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室，上海 200072;3. 復旦大學附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040)

目的 探討硝苯地平(Nifedipine)對人牙齦成纖維細胞(gingival fibroblasts, GFs)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)mRNA表達的影響。方法 取牙周手術(shù)切除的健康牙齦組織，組織塊法分離及培養(yǎng)獲得GFs,免疫細胞化學法對GFs進行鑒定。對GFs進行藥物刺激，分為硝苯地平組(1μg/ml)、LPS組(1μg/ml)、硝苯地平+LPS組(分別為1μg/ml)，同時設(shè)空白對照組。實時定量PCR檢測各組24、48h時MMP-1和MMP-2 mRNA的表達水平。結(jié)果 組織塊法獲得的GFs生長狀態(tài)良好；免疫細胞化學顯示，GFs抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性。與空白對照組相比，硝苯地平組刺激48h后MMP-1、MMP-2 mRNA表達減少(P<0.05)；硝苯地平+LPS組MMP-1 mRNA表達明顯增加(P<0.05)，MMP-2 mRNA表達無明顯變化。結(jié)論 硝苯地平可能通過影響GFsMMP-1和MMP-2基因的表達而影響牙齦增生。

牙齦成纖維細胞； 硝苯地平； 脂多糖； 基質(zhì)金屬蛋白酶

硝苯地平(nifedipine)作為一種鈣通道阻滯劑，被廣泛應用于心絞痛、高血壓等心血管疾病的治療，其不良反應之一是牙齦增生[1-2]，但其引起牙齦增生的機制目前尚不清楚。增生的牙齦組織以纖維化和不同程度的炎癥浸潤為特點[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類Ca2+、Zn2+依賴酶，在細胞外基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、纖維化等過程中起重要作用[4]。炎癥作為牙齦增生的促進因素之一，其中細菌脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)可能發(fā)揮重要作用。本研究以硝苯地平刺激人牙齦成纖維細胞，體外模擬炎癥環(huán)境，觀察硝苯地平對GFs MMP-1和MMP-2基因表達的影響，初步探討硝苯地平在體外正常及炎癥環(huán)境下誘導牙齦增生的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；2.5g/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；分散酶(dispaseⅡ)購自日本Roche公司；硝苯地平、LPS購自美國Sigma公司；小鼠抗人單克隆Vimentin抗體、廣譜角蛋白抗體購自中國凱基公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司；低溫高速離心機購自中國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀購自日本Roche公司。

1.2 人牙齦成纖維細胞原代培養(yǎng)

1.2.1 標本采集及處理 選擇來同濟大學附屬口腔醫(yī)院牙周科就診、無高血壓及其他系統(tǒng)性疾病、未曾服用致藥物性牙齦增生的相關(guān)藥物、需進行牙周手術(shù)治療的患者。經(jīng)患者知情同意后，采集冠延長術(shù)切除的牙齦組織，置于含雙抗的PBS液中。將組織清洗3次，剪切標本為2mm×3mm×3mm的小塊，加入2.5g/L分散酶，4℃消化，16～18h后進行原代培養(yǎng)。

1.2.2 人牙齦成纖維細胞原代培養(yǎng) 用組織鑷分離上皮與結(jié)締組織，取分離出的結(jié)締組織，用PBS清洗后接種于T25培養(yǎng)瓶，加入適量含100ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)基，置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4h后翻瓶。培養(yǎng)13～14d后細胞鋪滿瓶底約90%，以1∶1傳至10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。自第2代起，當細胞達80%～90%融合時，以1∶3或1∶4傳代至10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。第4～7代細胞用于后續(xù)實驗研究。

1.3 人牙齦成纖維細胞鑒定

取生長良好的GFs，做蓋玻片細胞爬片，多聚甲醛固定30min,PBS洗3次，每次5min；1ml/L Triton X-100處理15min，PBS洗3次，每次5min；滴加30ml/L過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；5%BSA封閉20min后滴加小鼠抗人單克隆Vimentin抗體和CK抗體(1∶200)，陰性對照組滴加PBS。玻片置濕盒內(nèi)，4℃過夜。次日取出玻片，室溫靜置1h，加二抗，室溫孵育30min，滴加DBA顯色液，蘇木素復染，脫水、透明，晾干后中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡拍照。

1.4 實時定量PCR檢測GFsMMP-1和MMP-2 mRNA的表達

1.4.1 樣本制備及實驗分組 取生長良好的GFs，0.5g/L胰酶消化后計數(shù)，用含100ml/L FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，分別接種于6孔板，每孔2ml。待細胞融合約70%時，更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含20ml/L FBS)。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，分別加入不同藥物進行刺激: 硝苯地平組(1μg/ml)，LPS組(1μg/ml)，硝苯地平+LPS組(分別為1μg/ml)，以上溶液均以基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制，以不含任何藥物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照組。藥物分別作用24、48h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入TRIzol 1ml,冰上裂解10min，收集混合液于1.5ml EP管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

硝苯地平藥液配制: 硝苯地平以無水乙醇為溶劑配成10-2mol/L的原液，-20℃避光保存。使用時以培養(yǎng)基稀釋成1μg/ml的工作液，4℃避光保存，1周內(nèi)使用。

脂多糖藥液配制: 將1mg LPS完全溶解于1ml生理鹽水中，獲得1mg/ml LPS原液，-20℃保存。使用時用培養(yǎng)基稀釋成1μg/ml 的工作液，4℃避光保存，1周內(nèi)使用。

1.4.2MMP-1、MMP-2基因表達的實時定量PCR檢測 TRIzol法提取細胞總RNA，每個樣本取1μg RNA，使用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進行實時定量PCR反應。反應條件如下: 95℃,預變性600s；變性95℃,10s;退火60℃,10s;延伸72℃，20s;PCR反應40個循環(huán);溶解曲線分析95℃，10s;65℃,60s;97℃,1s。用軟件Primer Premier 6設(shè)計引物，見表1。

表1 引物序列Tab. 1 Sequences of primers

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，多重比較用LDS-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 GFs體外細胞培養(yǎng)

采用組織塊法進行GFs原代培養(yǎng)，5～6d后有細胞從組織塊周圍爬出，13～14d待細胞大量融合后進行傳代。倒置顯微鏡下觀察，細胞呈長梭形或星形。原代培養(yǎng)的細胞以組織塊為中心生長，傳代后的細胞呈放射狀或漩渦狀走形，排列緊密，見圖1。

圖1 人牙齦成纖維細胞培養(yǎng)Fig.1 The culture of GFs(×100)A： 原代HGFs；B： 第4代HGFs

2.2 GFs細胞鑒定結(jié)果

本實驗所獲得的GFs抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證明細胞為中胚層來源，見圖2。

圖2 人牙齦成纖維細胞免疫細胞化學鑒定結(jié)果Fig.2 The result of immunocytochemistry for GFs(×100)A: 細胞抗波形絲蛋白染色陽性；B： 細胞抗角蛋白染色陰性

2.3 硝苯地平對GFsMMP-1、MMP-2 mRNA表達的影響

與對照組相比，硝苯地平作用24h時，MMP-1 mRNA表達量無明顯變化，48h時MMP-1 mRNA表達明顯減少(P<0.05)；LPS組及硝苯地平+LPS組，MMP-1 mRNA的表達量隨時間延長而減少，但均比對照組表達增加(P<0.05)，見圖3。

與對照組相比，硝苯地平組MMP-2 mRNA表達減少，且48h時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；硝苯地平+LPS組MMP-2 mRNA表達減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖3 硝苯地平對GFs MMP-1 mRNA表達的影響Fig.3 The effect of nifedipine on the mRNA expression of MMP-1與對照組相比，*P<0.05

圖4 硝苯地平對GFs MMP-2 mRNA表達的影響Fig.4 The effect of nifedipine on the mRNA expression of MMP-2 與對照組相比，*P<0.05

3 討 論

藥物性牙齦增生(drug-induced gingival overgrowth, DIGO)是指長期服用某種藥物而引起的牙齦組織過度生長和體積增大。組織病理學發(fā)現(xiàn): 硝苯地平引起的牙齦增生以細胞外基質(zhì)增多，特別是Ⅰ型膠原和不同程度的炎癥浸潤為特點[5-6]。研究認為，膠原的過度堆積可能與MMP及其抑制劑之間的失衡而引起膠原合成增加或降解減少有關(guān)。但硝苯地平引起牙齦增生的分子機制目前尚不清楚，故本實驗將硝苯地平作用于牙齦成纖維細胞，并加入LPS作為炎癥刺激，觀察正常及炎癥環(huán)境下，硝苯地平對牙齦成纖維細胞MMP-1和MMP-2基因表達的影響，初步探討硝苯地平誘導牙齦增生的分子機制。

MMPs是一類Ca2+、Zn2+依賴酶，在細胞外基質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)、纖維化等過程中起重要作用[4]。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種[7-8]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用底物的特性分為6大類: 膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解酶、膜型金屬蛋白酶、細胞溶解素及其他MMPs類。其中，MMP-1是一種膠原酶，由成纖維細胞、吞噬細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞等合成和分泌，可降解細胞外基質(zhì)中最為豐富的蛋白即膠原，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖的核心蛋白等；MMP-2是一種明膠酶，由成纖維細胞、多形核中性粒細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原、明膠、纖維連結(jié)蛋白、蛋白多糖、彈性蛋白[9-10]。鑒于MMP-1和MMP-2均可由成纖維細胞合成和分泌，且在細胞外基質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用，因此，本實驗選擇MMP-1和MMP-2為檢測指標。

有學者認為DIGO的發(fā)生與藥物濃度密切相關(guān)，牙周的局部藥物濃度可能決定了藥物對牙齦成纖維細胞的作用。有研究[11]表明牙齦增生患者齦溝液中的藥物濃度遠高于血藥濃度，因此本研究選擇1μg/ml的藥物濃度用于實驗研究，較接近藥物的局部濃度。本實驗發(fā)現(xiàn): 在硝苯地平作用下，MMP-1 mRNA的表達量24h時無明顯變化,而48h時明顯減少(P<0.05)；MMP-2 mRNA的表達量也明顯減少(P<0.05)，表明硝苯地平可能通過減少MMP-1和MMP-2基因的表達，使膠原降解減少，而參與細胞外基質(zhì)的堆積。已有的研究也表明硝苯地平可減少MMPs的分泌。Maita等[12]將硝苯地平與正常牙齦成纖維細胞共同培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，10μmol/L濃度的硝苯地平可以明顯降低MMP-1蛋白的表達量。

許多研究[13-14]表明，菌斑引起的炎癥與DIGO的發(fā)生以及嚴重程度有關(guān)。LPS作為革蘭陰性菌的主要毒力因子，可以激活多種靶細胞而參與各種炎癥介質(zhì)及細胞因子的產(chǎn)生,而可能會改變細胞對藥物產(chǎn)生的應答。本實驗模擬炎癥狀態(tài)下硝苯地平的作用情況，將硝苯地平與LPS共同作用于牙齦成纖維細胞，發(fā)現(xiàn): 與對照組相比，MMP-1 mRNA的表達量明顯增加，且24h時更加顯著(P<0.05)，MMP-2表達無明顯變化。說明炎癥因子可參與調(diào)節(jié)MMPs的表達，一定程度上逆轉(zhuǎn)硝苯地平對MMPs表達的抑制作用，但具體機制有待進一步研究。

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Effects of nifedipine on expression of matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-2 in human gingival fibroblasts

CHENLong-jie1，2,YANGJun1，2,LIWu-li1，2,ZHAOShou-liang1,3

(1. Dept. of Endodontics, Stomatology Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China;2. Laboratory of Oral Biomedical Science and Translational Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, China；3. Dept. of Stomatology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Objective To investigate the effects of nifedipine on the expression of matrix metalloproteinase-1(MMP-1) and matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in human gingival fibroblasts (GFs)invitro. Methods The gingival tissue specimens obtained from periodontal surgery were culturedinvitro. GFs were identified by immunocytochemistry. The expression levels ofMMP-1 andMMP-2 mRNA in GFs were detected by quantitative Real-Time PCR after cells stimulated by nifedipine(1μg/ml), LPS (1μg/ml) and nifedipine (1μg/ml)+LPS(1μg/ml). Results GFs culturedinvitroshowed vimentin positive and keratin negative signal. The mRNA expression ofMMP-1 andMMP-2 were significantly down-regulated after 48h treatment of nifedipine. The mRNA expression ofMMP-1 was significantly up-regulated after GFs were treated with nifedipine+LPS, whereas there were no significant changes inMMP-2 expression. Conclusion These results suggest that nifedipine may be involved in proliferation of gingival fibroblasts through inhibition ofMMP-1 andMMP-2 expression.

gingival fibroblasts; nifedipine; lipopolysaccharide;matrix metalloproteinase

10.16118/j.1008-0392.2015.04.007

2015-04-08

國家自然科學基金(81170951)；上海市科委員醫(yī)學引導項目(10411964600)

陳龍杰(1988—)，女，碩士研究生.E-mail： dentistclj@126.com

趙守亮.E-mail： slzhao@#edu.cn

R 78

A

1008-0392(2015)04-0033-05