李淑敏，何冠蘅，阮經(jīng)文△，曾園山，李志玲

(1.廣東省工傷康復醫(yī)院，廣東 廣州510440;2.中山大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州510080;3.中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州510080)

脊髓損傷后的康復是一個漫長的過程，伴隨這一過程的治療投入也是巨大的，但結(jié)果差強人意，絕大部分患者最終還是需要在輪椅上度過后半生。正因如此，脊髓損傷后的治療是醫(yī)學領(lǐng)域中一個極具挑戰(zhàn)性的課題。醫(yī)務(wù)人員和科研工作者也曾經(jīng)尋求多種諸如手術(shù)、藥物、功能鍛煉等手段來對抗脊髓損傷，但療效有限。即使在追求突破的今天，人們嘗試了被認為最有前途的干細胞移植治療，從目前有限的臨床實驗來看，其臨床療效與實驗室的結(jié)果依然相去甚遠，且仍有許多相關(guān)問題有待解決。而在這樣的背景下，挖掘傳統(tǒng)療法在脊髓損傷治療中的優(yōu)勢就顯得非常必要。作為傳統(tǒng)針灸療法中“針”的部分的針刺療法，在脊髓損傷的臨床治療中已被廣泛應(yīng)用［1-2］。而另一重要組成部分的“灸”法，在這一領(lǐng)域似乎已被遺忘，極少人對其進行科學、深入的研究?；诖?，筆者探索性地對艾條灸治療脊髓損傷進行了初步的基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SD(Sprague-Dawley)雌性成年大鼠15 只(200 ～250 g)，隨機編號為1 ～15，采用EXCEL 編程生成隨機數(shù)，隨機數(shù)由大到小分配到3 組中，其所對應(yīng)的大鼠即被隨機分為3 組。①正常對照組(normal group):不損傷，不治療;②脊髓損傷組(SCI group):脊髓全橫斷術(shù)后不做任何治療;③艾條灸組(GV-M group):自SCI術(shù)后第7 天起，采用艾條灸督脈治療3 天。各組存活時間均為10 天。

1.2 全橫斷脊髓損傷大鼠模型的建立

造模方法參考文獻［3-4］:成年雌性SD 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg ～30 mg/kg)進行麻醉，切開皮膚，暴露T10段脊髓。剪開硬脊膜，快速全橫斷脊髓。充分止血，以明膠海綿覆蓋橫斷處，逐層縫合。術(shù)后每日肌注青霉素50000 U/kg，人工排尿，3次/日，至取材或恢復自主排尿功能。

1.3 治療方法

取穴:取距離SCI 段上下端兩個椎體的棘突間隙(T7和T11棘突下方，相當于督脈至陽和脊中兩穴)。操作:點燃艾條，對準應(yīng)灸部位，采用溫和灸法于距皮膚3 cm 處進行熏灸，每穴每次10 min，每天1 次，療程為3 天。

1.4 脊髓取材

各組動物均于實驗第10 天行BBB 評分后處死，置于冰盒上，撬開椎板，暴露脊髓，迅速取出T8～12脊髓節(jié)段(含損傷區(qū))置于-70℃下保存。取T9～11脊髓節(jié)段用于Western blot 檢測，T8與T12用于免疫熒光檢測。

1.5 檢測方法

免疫熒光檢測降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)在損傷脊髓鄰近節(jié)段的表達和分布:冰凍切片，丙酮固定，加1:10 正常山羊血清孵育，加一抗過夜，加入熒光二抗，甘油封片。以PBS 代替一抗作為陰性對照。觀察各組脊髓背角CGRP 陽性染色區(qū)面積變化。

CGRP 分布示意圖如圖1 所示，其在脊髓橫斷面中背角的分布如圖2 所示。

圖1 CGRP 分布示意圖

圖2 CGRP 在脊髓背角的分布

Western Blot 檢測損傷脊髓組織及鄰近節(jié)段CGRP 的含量:聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入一抗、二抗，進行顯色反應(yīng)，暗室內(nèi)曝光。

行為學評分:參照大鼠SCI 后功能評判標準(Basso，Beattie，Bresnahan，簡稱BBB 評分法)［5］，對各組實驗大鼠后肢運動功能進行評分。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組脊髓背角CGRP 陽性染色區(qū)面積觀察比較

從圖3 中可以直觀的看出，SCI 組CGRP 陽性染色區(qū)面積，與對照組、艾條灸組比較明顯減小，艾條灸組與對照組CGRP 陽性染色區(qū)面積相近。

圖3 各組脊髓背角CGRP 陽性染色區(qū)面積

2.2 CGRP 含量的變化

與艾條灸組、對照組相比，SCI 組的CGRP 條帶變得明顯窄小，其相對灰度值的比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05);與對照組相比，艾條灸組CGRP 條帶的寬度無明顯變化，其相對灰度值比較，差異也無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖4。

圖4 各組脊髓背角CGRP 條帶及灰度值的比較

2.3 行為學改變

術(shù)前各組BBB 評分均為21 分。SCI 組和艾條灸組術(shù)后評分均為0 分，術(shù)后第10 天結(jié)果如圖5 所示，兩組評分較術(shù)后均有所增加，且艾條灸組評分增幅較大，但兩組評分之間的差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

圖5 脊髓損傷組與艾條灸組BBB 評分比較

3 討論

針刺治療疾病，非常強調(diào)針下的得氣，這在《靈樞·九針十二原》中早有記載:“刺之要，氣至而有效”，“刺之而氣不至，無問其數(shù)”，清楚地表明“氣至”是針刺取效的關(guān)鍵。而脊髓損傷的患者，其病灶平面以下的感覺基本消失，隨之消失的還有患者對針刺的感應(yīng)，即在這些部位針刺患者無酸、麻、重、脹的感覺，即沒有得氣感，從而導致毫針治病“氣至則有效”的基本要求難以達到。這可能是目前針刺治療截癱病人療效差的主要原因，其具體緣由值得進一步探討。與此相反，艾灸治療疾病，鮮有強調(diào)艾灸的操作必須得氣的記載和要求，從古至今，多數(shù)觀點均認為艾灸療效的關(guān)鍵在于溫熱效應(yīng)［6］，而所謂“溫熱效應(yīng)”就是通過艾灸燃燒時的熱過程影響患者機體的生物效應(yīng)，比如艾灸對機體熱休克蛋白的影響［7-8］，以及艾灸時的紅外線輻射，不但為機體細胞代謝、免疫功能提供必要的能量，也為能量缺乏的病態(tài)細胞提供活化能［9］。

眾所周知，能量過程是生命系統(tǒng)中的基本過程，而熱是能量過程的重要表現(xiàn)形式，生命現(xiàn)象的各個層次無不包含熱效應(yīng)［10］。脊髓損傷后的康復需要更多的能量補給，熱效應(yīng)就是提供此種能量的方式之一。艾灸熱作為一種特殊的熱能介入方式，燃燒時除了能夠直接給局部施加熱能外，還產(chǎn)生一種十分有效并適宜于機體的遠、近紅外線。一方面，遠紅外線能直接作用于人體的表淺部位，利用物理傳導方式擴散熱量;另一方面，波長短、能量強的近紅外線，可穿透組織深達10 mm左右，這些熱能通過毛細血管網(wǎng)和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)傳到更廣泛的部位，為人體所吸收［11-12］，從而發(fā)揮灸法的熱效應(yīng)，為機體提供能量，也為脊髓損傷后神經(jīng)再生所需能量提供了保證。

CGRP 作為一種新型的神經(jīng)肽，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷可引起CGRP 表達明顯下調(diào)，且在1 個月內(nèi)，CGRP 水平?jīng)]有恢復［13］。另外，CGRP 能促進SCI 后運動功能的恢復［14］，對神經(jīng)元的可塑性也起著重要作用［15］。所以，在損傷早期CGRP 的表達情況可以作為評定脊髓修復再生的一個指標。

實驗結(jié)果表明:通過短暫的3 天艾條灸治療，艾條灸組大鼠的CGRP 的表達明顯高于單純脊髓損傷組(P ＜0.05)，而接近正常對照組(P ＞0.05)，可能就是通過灸法的能量補給機制，促進了CGRP 的合成。雖然CGRP 主要由神經(jīng)細胞合成，但也有學者的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮自身也能合成［16］。因此，盡管某些平面的神經(jīng)受損，但血管網(wǎng)絡(luò)保存完好，在獲得灸能的補充后，能迅速合成因脊髓損傷而減少的CGRP，并通過毛細血管網(wǎng)和經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)對灸能進行區(qū)域廣泛的傳導，跨過損傷區(qū)，傳導到損傷平面以上的神經(jīng)，使正常神經(jīng)細胞迅速合成CGRP，從而能在短時間內(nèi)上調(diào)CGRP 的表達，并接近正常范圍。當然，灸法對機體的調(diào)節(jié)作用是多靶點、多途徑的，其對脊髓損傷的治療除了CGRP之外，應(yīng)該還存在許多其它的途徑和靶點，有待今后繼續(xù)探索。本實驗的另一結(jié)果:艾條灸組與單純脊髓損傷組之間BBB 評分的差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，這可能與治療時間較短有關(guān)。而且，盡管兩組的行為學評分無統(tǒng)計學意義，但艾條灸組評分還是表現(xiàn)出優(yōu)于單純脊髓損傷組的趨勢，值得今后延長治療時間再進行觀察。本次實驗總體結(jié)果提示，溫通法治療脊髓損傷是有效的，值得推廣和深入研究。

從中醫(yī)角度來看，脊髓損傷的實質(zhì)是督脈損傷，其所表現(xiàn)的截癱或四肢癱瘓，以肢體痿廢不動為主，常伴有手足不溫、背冷、畏風等陽虛之癥，這些癥狀在陰陽屬性中屬于陰證范疇，為灸法的適應(yīng)癥。加上平面以下針感消失，影響針刺效果?！夺t(yī)學入門·針灸》云:“藥之不及，針之不到，必須灸之?！庇纱丝梢?，無論在現(xiàn)代基礎(chǔ)研究還是傳統(tǒng)中醫(yī)理論下，溫通法都是值得在脊髓損傷的治療中推廣和應(yīng)用的。

［1］ Chen YY，Zhang W，Chen YL，et al. Electro-acupuncture improves survival and migration of transplanted neural stem cells in injured spinal cord in rats［J］.Acupunct Electrother Res，2008，33(1-2):19-31

［2］ 丁英，曾園山，陳雅云，等. 督脈電針與夾脊電針對受損傷的大鼠脊髓背核神經(jīng)元存活及其NOS 表達的影響比較［J］.中國康復醫(yī)學雜志，2006，21(1):8-10

［3］ Ding Y，Yan Q，Ruan JW，et al. Electro-acupuncture promotes survival，differentiation of the bone marrow mesenchymal stem cells as well as functional recovery in the spinal cord- transected rats［J］.BMC Neurosci，2009，10:35-47

［4］ Wakabayashi Y，Komori H，Kawa-Uchi T，et al. Functional recovery and regeneration of descending tracts in rats after spinal cord transection in infancy［J］.Spine，2001，26(11):1215-1222

［5］ Basso DM，Beattle MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.J Neurotrauma，1995，12(1):1-21

［6］ Freire AO，Sugai GC，Blanco MM，et al.Effect of moxibustion at acupoints Ren-12(Zhongwan)，St-25(Tianshu)，and St-36(Zuzanli)in the prevention of gastric lesions induced by indomethacin in Wistar rats［J］.Digestive Diseases and Sciences，2005，50(2):366-374

［7］ 易受鄉(xiāng)，彭艷，常小榮，等. 艾灸對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡的影響及其與熱休克蛋白表達關(guān)系的研究［J］.針刺研究，2006，31(5):259-271

［8］ 郁潔，易受鄉(xiāng)，常小榮，等.艾灸足三里、梁門穴對大鼠不同組織器官HSP70 表達的影響［J］. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2009，29(4):67-69

［9］ 梅全喜，王劍. 不同產(chǎn)地艾葉燃燒放熱量的比較［J］. 中藥材，1994，17(9):46

［10］ 趙南明，王存誠.生命科學與熱物理學再次相遇—生命系統(tǒng)中的熱耦合問題［J］.物理，1998，27(3):146-150

［11］ 楊華元，劉堂義.艾灸療法的生物物理機制初探［J］.中國針灸，1996，16(10):17

［12］ 王磊，李學武，張莉.艾灸療法作用機理國內(nèi)外研究進展［J］.中國針灸，2001，21(9):567-570

［13］ 段平國，劉德明.降鈣素基因相關(guān)肽與神經(jīng)損傷修復［J］.四川解剖學報，2006，14(1):44-46

［14］ 歐喜超，楊朝陽，劉玉軍，等.大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復及前角運動神經(jīng)元功能的改變［J］.中國康復理論與實踐，2008，14(3):231-233

［15］ Miki K，F(xiàn)ukuoka T，Tokunaga A，et al.Calcitonin gene-related peptide increase in the rat spinal dorsal horn and dorsal column nucleus following peripheral nerve injury:Up-regulation in a subpopulation of primary afferent sensory neurons［J］. Neurosci，1998，82(4):1243-1252

［16］ 張毅民，彭軍，李元建.降鈣素基因相關(guān)肽合成與釋放調(diào)節(jié)［J］.國際病理科學與臨床雜志，2010，30(2):153-157