施荷等

摘 要：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳方法研究真空包裝的冷卻鹿肉貯藏過程中的菌相變化。將冷卻鹿肉真空包裝貯藏于0～2 ℃條件下，每隔5 d取出，利用細(xì)菌試劑盒提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳分析，同時(shí)對16S rDNA V3 區(qū)的DGGE 圖譜進(jìn)行割膠測序，檢測到貯藏末期主要是蘇黎世克羅諾桿菌、斯氏普羅威登斯菌，棕色類香味菌，乳酸發(fā)酵類梭菌等成為優(yōu)勢腐敗菌。

關(guān)鍵詞：冷卻鹿肉；真空包裝；菌相變化；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

Microfloral Changes of Vacuum Packaged Venison during Chilled Storage

SHI He1， HU Tiejun2，*， QIN Fengxian3， CHEN Wei3， LIU Jing4， WANG Zhaohui5， JIA Dongshu6， WU Jun6，

YOU Lixin6， CHEN Haiyan6， YU Yan6， LIU Fang6， MA Jinxi6， YANG Bin6， ZHANG Tiehua7

（1. College of Agriculture， Yanbian University， Yanji 133002， China；

2. Jilin Dongao Deer Industry Science and Technology Development Co. Ltd.， Changchun 130600， China；

3. Engineering Research Center of Deer Industry of Jilin Province， Changchun 130600， China；

4. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Changchun 130062， China；

5. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

6. College of Organism and Food， Changchun University of Science and Technology， Changchun 130600， China；

7. College of Quartermaster Technology， Jilin University， Changchun 130012， China）

Abstract： The microfloral changes of vacuum packaged venison during chilled storage were examined using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）. Samples were collected at 5-day intervals during the storage for bacterial DNA extraction using a DNA extraction kit before PCR-DGGE analysis. The band of 16S rDNA V3 region from the DGGE analysis was excised for sequence analysis. The dominant spoilage bacteria at the end of the storage included Cronobacter turicensis， Providencia stuartii， Myroides phaeus， Clostridium lactatifermentans.

Key words： chilled venison； vacuum packaging； microfloral change； PCR-DGGE

中圖分類號：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）04-0015-05

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504004

冷卻肉是指牲畜在屠宰前要嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)檢疫，屠宰后的胴體迅速冷卻，使其溫度（以后腿內(nèi)部為測量點(diǎn)在24 h內(nèi)降到0～4 ℃，在之后的加工、運(yùn)輸和銷售中始終保持在0～4 ℃范圍內(nèi)的鮮肉[1]。冷卻肉相對熱鮮肉，冷凍肉品質(zhì)優(yōu)良、滋味鮮美，且微生物生長受到抑制[2]。研究表明冷卻鹿肉也具有冷卻肉的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。

畜體在屠宰加工過程中避免不了被細(xì)菌污染，存在肉類表面的細(xì)菌往往能很牢固地吸附在肉的表面 [3]。隨著貯藏時(shí)間的延長，細(xì)菌的菌相構(gòu)成會(huì)發(fā)生變化，凸顯出優(yōu)勢菌群，引起冷卻肉腐敗變質(zhì)[4]。

研究表明，由于各種細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，對產(chǎn)品的腐敗作用（腐敗時(shí)間、腐敗類型）不同。研究其貯藏過程數(shù)量和種類的變化，以便采取具有針對性的措施抑制優(yōu)勢菌群的生長繁殖[5-6]。變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)在奶酪、香腸、酸面團(tuán)、泡菜、葡萄酒等食品貯藏過程中微生物變化研究方面均有報(bào)道[7]。DGGE可不采用培養(yǎng)方法，而從食物樣品中直接提取微生物的總DNA，檢測到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的多種微生物，而且檢測速度快。近年來，應(yīng)用DGGE技術(shù)研究不同包裝冷卻肉貯藏過程中的菌相變化亦有報(bào)道[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)將冷卻鹿肉真空包裝低溫貯藏，在不同貯藏時(shí)期不經(jīng)培養(yǎng)直接提取鹿肉中細(xì)菌DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)，研究菌相變化，揭示貯藏末期主要優(yōu)勢腐敗菌，了解其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究肉品的保鮮方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采取長春世鹿集團(tuán)剛屠宰的新鮮鹿后腿肉。

引物 金斯瑞生物科技有限公司；dNTP堿基、rTaq酶、pMD18-T Cloning Kit 美國TaKaRa公司；DNA純化試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞 天根生化科技（北京）有限公司；40%丙烯酰胺/甲叉（Acrylamide/Bis）

美國伯樂Bio-Rad公司；CTAB環(huán)境微生物DNA提取試劑盒、TAE Buffer緩沖液 北京博友順生物科技有限公司；

去離子甲酰胺、過硫酸銨、尿素 美國Amresco公司；N，N，N，N-四甲基二乙胺 德國Sigma公司；AgNO3染色液、甲醛、冰醋酸、氫氧化鈉、乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；聚丙烯酰胺膠回收純化試劑盒（Poly-Gel DNA Extraction Kit） 美國Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5415D離心機(jī) 德國Eppendorf公司；T-gradient PCR儀 德國Biometra公司；SDC-6恒

溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；JY-SPFT電

泳儀 北京君意東方儀器有限公司；Gel-Doc2000凝膠成像儀 美國伯樂Bio-Rad公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-100C搖床

上海智城分析儀器制造有限公司；DCode變性梯度凝膠電

泳儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

在無菌室內(nèi)分切為7塊，分別編號為9.19、9.22、9.26、10.01、10.06、10.10、10.14，采用無菌多層復(fù)合包裝袋分別進(jìn)行真空熱縮包裝（真空度0.1 MPa，抽空時(shí)間40 s，熱封溫度90℃，熱封時(shí)間3 s），0～4 ℃貯存，待測。

1.3.2 直接提取冷卻鹿肉細(xì)菌DNA

無菌剪取一定肉樣，用滅菌剪刀剪碎，精確稱取5 g碎肉樣，放入滅菌錐形瓶（內(nèi)有100 mL滅菌生理鹽水），搖床280 r/min、4 ℃條件振搖15 min[9，11]，靜置5 min，取30 mL上清液于一滅菌離心管中，200 r/min離心5 min后，取15 mL上清液于另一滅菌離心管中，12 000 r/min離心10 min。離心所得沉淀，采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。分別于第0、5、10、15、20、25、30天測試。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物

GC-338F和518R擴(kuò)增樣品16S rDNA高變區(qū)序列。

PCR擴(kuò)增體系（50 μL）如下：10×PCR Buffer緩沖液：5 μL；dNTP堿基（2.5 mmol/L）3.2 μL；rTaq酶

（5 U/μL）0.4 μL；上游引物GC-338F（20 μmol/L）1 μL；下游引物518R（20 μmol/L）1 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)去離子水50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物采用DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.3.4 PCR-DGGE分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變形梯度為35%～55%、8%的聚丙烯酰胺凝膠（化學(xué)變性劑為100%尿素（7 mol/L）和40%丙烯酰胺溶液）在1×TAE緩沖液中150 V，60 ℃條件下電泳5 h。最后用終止液（乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL）終止反應(yīng)。

DGGE完畢后、采用銀染法染色：固定液（乙醇 50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL）固定15 min；Milli-Q純水清洗、20 s和2 min各1 次；銀染液（硝酸銀1 g、37%甲醛0.75 mL、定容500 mL）染色15 min； Milli-Q純水清洗、20 s和2 min各1 次；顯色液（氫氧化鈉7.5 g、37%甲醛2.5 mL、定容500 mL）顯色5～7 min。

1.3.5 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用Omega公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如與1.3.3節(jié)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析，測序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以GC-338F和518R為引物擴(kuò)增16S rDNA序列、得到約200 bp的DNA片段（圖1）用于DGGE分析。

由圖2、3可知，貯藏初期產(chǎn)生較多條帶，表明鹿肉初始菌種類不多，細(xì)菌主要來自鹿肉在屠宰加工過程中環(huán)境污染；隨著貯藏時(shí)間的延長，條帶分布發(fā)生明顯變化，一些條帶逐漸變?nèi)趸蛳?，一些條帶由弱變強(qiáng)，還出現(xiàn)一些新條帶，表明細(xì)菌在冷藏階段發(fā)生變化；至貯藏末期，亮條帶在圖譜上發(fā)生了很大的變化，表明貯藏過程中菌相組成發(fā)生了顯著變化。結(jié)合圖4量化分析膠圖，初期菌種編號主要是2、3、4和6號，2號逐漸消失，3、4號逐漸減弱，但是一直存在；末期菌種編號主要是1、10、15、17和19號；貯藏過程當(dāng)中，一直存在的菌種編號為3、4、7和13號。

2.3 主要電泳條帶序列測定

DGGE凝膠條帶回收后，以338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約200 bp的DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆測序。序列結(jié)果見表2。

每個(gè)回收條帶選取3個(gè)克隆進(jìn)行了序列測定。登錄NCBI用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中與參考序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果如表2所示。各條帶相似性在98%以上。由圖3和表2可知，第0天時(shí)，肉中存在的初始污染菌主要有Cronobacter dublinensis（普羅威登斯菌，條帶4）、Erysipelothrix rhusiopathiae（丹毒絲菌，條帶6）等；而貯藏末期存在優(yōu)勢菌屬主要有Cronobacter turicensis（蘇黎世克羅諾桿菌，條帶1）、Providencia stuartii（斯氏普羅威登斯菌，條帶10）、Myroides phaeus（棕色類香味菌，條帶15）、Clostridium lactatifermentans（乳酸發(fā)酵類梭菌，條帶19）等，表明貯藏末期鹿肉中菌相相對貯藏初期復(fù)雜很多。有些條帶未被測定，有些條帶測定失敗。

3 討 論

冷卻肉由于其品質(zhì)優(yōu)良滋味鮮美，越來越受到消費(fèi)者的喜愛，故研究冷卻肉中的優(yōu)勢腐敗菌非常重要[11]。由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)操作步驟繁瑣且鑒定出來的微生物數(shù)量有限，而PCR-DGGE能快速準(zhǔn)確地分析出冷卻肉菌相的變化，所以運(yùn)用PCR-DGGE來分析冷卻肉貯藏期間微生物的變化越來越流行[12]。

冷卻肉在生產(chǎn)和流通過程中，雖然一直處于低溫控制下（0～4 ℃），但仍然污染了一些嗜冷菌，如單核細(xì)胞李斯特增生菌和假單胞菌屬等，它們在冷藏條件下仍會(huì)大量生長和繁殖，最終導(dǎo)致冷卻肉發(fā)生腐敗變質(zhì)[13-16]。研究表明，引起冷卻肉腐敗最常見的細(xì)菌有假單胞菌屬、放線桿菌、乳酸桿菌、黃桿菌、產(chǎn)堿桿菌和腸桿菌屬的一些菌屬[17]。Li Miaoyun等[13]運(yùn)用DGGE方法研究真空包裝豬肉貯藏期間菌相的變化，通過對細(xì)菌16S rRNA 基因V6～V8可變區(qū)的研究表明乳桿菌和熱死環(huán)絲菌為其貯藏末期的主要腐敗菌。于見亮[18]對冷卻羊肉的初始菌相進(jìn)行分析表明，冷卻豬肉初始菌相主要有假單胞菌屬、熱死環(huán)絲菌、葡萄球菌、乳酸菌屬、腸桿菌屬，且假單胞菌屬為冷卻豬肉初始菌相的優(yōu)勢微生物。

由于在貯藏期間各個(gè)菌群的最適合生長條件是不同的，且菌群之間也存在一定的相互作用（拮抗、競爭、互利、共生），所以在貯藏期間菌群會(huì)隨著時(shí)間的變化而變化，其中的一種或者幾種會(huì)成為影響冷卻肉腐敗的優(yōu)勢菌群，其他菌群會(huì)慢慢減弱甚至消亡[19-21]。

本研究中2、3和4號樣品失去了包裝優(yōu)勢，而1、10、15和19號樣品含量上升占為主要優(yōu)勢，成為冷卻鹿肉腐敗變質(zhì)的主要菌群?？梢愿鶕?jù)這些細(xì)菌的生物學(xué)特性篩選出安全優(yōu)質(zhì)的天然保鮮劑，為以后進(jìn)一步抑制使鹿肉變質(zhì)的細(xì)菌提供可靠地理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR-DGGE法對冷卻鹿肉貯藏期間的菌相變化分析表明：在鹿肉貯藏初期主要細(xì)菌為Cronobacter dublinensis（普羅威登斯菌）、Erysipelothrix rhusiopathiae（丹毒絲菌）；貯藏中期斯氏普羅威登斯菌活力逐漸增強(qiáng)，并出現(xiàn)了Cronobacter turicensis（蘇黎世克羅諾桿菌）、Providencia stuartii（斯氏普羅威登斯菌）、Myroides phaeus（棕色類香味菌）、Clostridium lactatifermentans（乳酸發(fā)酵類梭菌）等菌屬；Erysipelothrix rhusiopathiae str. Fujisawa（丹毒絲菌屬）、Aeromonas eucrenophila（嗜框泉?dú)鈫伟┑染鷮儆幸欢ǖ纳婺芰?，隨著時(shí)間的延長逐漸減少、消失；貯藏末期優(yōu)勢菌屬為有Cronobacter turicensis（蘇黎世克羅諾桿菌）、Providencia stuartii（斯氏普羅威登斯菌）、Myroides phaeus（棕色類香味菌）、Clostridium lactatifermentans（乳酸發(fā)酵類梭菌）。

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