祖海濤　蘇良科　朱連德

(勃林格殷格翰國(guó)際貿(mào)易(上海）有限公司動(dòng)物保健部，北京100010）

經(jīng)典毒株P(guān)RRSV弱毒疫苗
對(duì)高致病性PRRSV的臨床控制報(bào)告

祖海濤蘇良科朱連德

(勃林格殷格翰國(guó)際貿(mào)易(上海）有限公司動(dòng)物保健部，北京100010）

摘要：本文介紹了某確診為HP-PRRS的規(guī)模豬場(chǎng)豬只的臨床癥狀，鑒別診斷，實(shí)驗(yàn)室血清、分子生物學(xué)和基因測(cè)序的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)發(fā)病的主要原因是HP-PRRS的感染并伴有PCV2感染。豬場(chǎng)通過(guò)更換疫苗和改變措施，防控效果有所改善。通過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)，針對(duì)中國(guó)目前的藍(lán)耳病毒株，“經(jīng)典株”P(pán)RRS疫苗對(duì)高致病性PRRSV變異藍(lán)耳病也具有良好的免疫保護(hù)效果?？傊?，在合理使用弱毒疫苗的同時(shí)，科學(xué)的豬場(chǎng)管理和嚴(yán)格的生物安全對(duì)于藍(lán)耳病的防控也是至關(guān)重要的。

關(guān)鍵詞：藍(lán)耳??；發(fā)病情況；檢測(cè)；防控

藍(lán)耳病即豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），是目前危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，在全球大部分地區(qū)流行[1]。該病在我國(guó)普遍存在，特別是2006—2007年高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRS）暴發(fā)后，給我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大損失[2-4]。

2007年至今，我國(guó)相繼問(wèn)世NVDC-JXA1株高致病性藍(lán)耳病滅活疫苗，CH-1R株、R98株、JXA1-R株、HuN4F112株、TJMF92株等經(jīng)典和高致病性藍(lán)耳病弱毒活疫苗，以及較早的CH-1a株經(jīng)典藍(lán)耳病滅活疫苗和進(jìn)口的Ingelvac PRRS MLV VR2332株減毒活疫苗，這些疫苗的推廣和應(yīng)用對(duì)控制和減緩疫情蔓延起到了積極的作用[5,6]。但是近年來(lái)，由于養(yǎng)豬場(chǎng)對(duì)高致病性藍(lán)耳病病原認(rèn)識(shí)不清，加之獸醫(yī)人員對(duì)藍(lán)耳病弱毒活疫苗特性了解不足，濫用疫苗現(xiàn)象普遍，再加上各豬場(chǎng)豬群的疾病背景不同，免疫程序更是千差萬(wàn)別，臨床上暴發(fā)高致病性藍(lán)耳病豬場(chǎng)病例有抬頭趨勢(shì)[7]。許多豬場(chǎng)出現(xiàn)過(guò)免疫HPPRRS疫苗但還是發(fā)生HP-PRRS的現(xiàn)象，導(dǎo)致很多豬場(chǎng)對(duì)是否要進(jìn)行藍(lán)耳病疫苗免疫處在觀望或迷茫狀態(tài)。

1　豬場(chǎng)背景

湖北某規(guī)模化商品豬場(chǎng)，現(xiàn)存欄經(jīng)產(chǎn)母豬500頭。母豬品種為長(zhǎng)大二元，公豬品種為杜洛克，生產(chǎn)杜長(zhǎng)大三元雜交商品豬。單點(diǎn)式飼養(yǎng)管理模式，自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出。仔豬在21日齡斷奶，斷奶當(dāng)天轉(zhuǎn)入保育舍，70日齡從保育舍轉(zhuǎn)入育肥舍。

豬場(chǎng)主要疫苗的免疫程序如下。

母豬：高致病性藍(lán)耳病疫苗（TJM-F92株）普免4次/年；豬瘟高效細(xì)胞疫苗普免3次/年；偽狂犬疫苗普免4次/年；

仔豬：仔豬出生后3日齡內(nèi)滴鼻偽狂犬疫苗、55日齡二免（肌肉注射）；15日齡免疫高致病性藍(lán)耳病疫苗（TJM-F92株）活疫苗和全病毒滅活圓環(huán)病毒疫苗各1頭份；豬瘟高效細(xì)胞疫苗35日齡首免，65日齡二免。

豬場(chǎng)遠(yuǎn)離養(yǎng)殖高密度區(qū)，自然防疫條件較好。在藍(lán)耳病的防控方面，后備種豬一直是定點(diǎn)引種，引入時(shí)采取嚴(yán)格隔離，生產(chǎn)成績(jī)一直很好而且穩(wěn)定。

2　豬場(chǎng)發(fā)病情況

自2014年4月開(kāi)始，產(chǎn)房存活率下降，仔豬轉(zhuǎn)入保育舍后10天左右（即在30日齡）陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為慢性消瘦、厭食、精神沉郁、打噴嚏、流鼻涕，部分豬發(fā)高燒。急性死亡豬皮膚發(fā)紺，慢性經(jīng)過(guò)豬表現(xiàn)被毛粗亂，貧血、皮膚蒼白、衰竭無(wú)力，后腿關(guān)節(jié)腫大。到55日齡進(jìn)入發(fā)病高峰，豬呼吸道病癥狀較嚴(yán)重，進(jìn)入圈舍明顯聽(tīng)到育成豬咳嗽、打噴嚏；20%左右育成豬被毛長(zhǎng)，脊椎骨突出，消瘦，死淘率可達(dá)10%，經(jīng)濟(jì)損失巨大。發(fā)病豬只的臨床表現(xiàn)為體溫41℃以上，腹式呼吸，采食量下降，腹瀉。

在發(fā)病豬群，豬場(chǎng)加強(qiáng)了欄舍消毒、病豬隔離等生物安全措施，并在飼料和飲水中加入阿莫西林、氟苯尼考等多種抗生素和中藥制劑進(jìn)行治療，但效果不佳。

病死保育豬解剖后主要以肺臟病變?yōu)橹?，肺臟充血、出血、肺小葉間質(zhì)增寬，局灶性肺實(shí)變，肺臟肉變，肺門(mén)淋巴結(jié)水腫呈棕黃色；腹股溝淋巴結(jié)水腫，切面多汁。個(gè)別豬心包積液并有纖維滲出物，心肌表面呈“絨毛心”。

母豬群的健康一直沒(méi)有受到影響，產(chǎn)后配種率、分娩率都維持在原來(lái)正常水平。

2014年7月豬場(chǎng)采集了日齡都在60左右的發(fā)病豬及健康豬的血樣各10份，送正大集團(tuán)實(shí)驗(yàn)室做抗體檢測(cè)，同時(shí)采集3份病料送到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行病原學(xué)檢查。

3　實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

3.1血清抗體檢測(cè)

將采集的血液樣品分別進(jìn)行藍(lán)耳病抗體和豬瘟抗體的檢測(cè)。

PRRSV抗體監(jiān)測(cè)試劑盒使用美國(guó)愛(ài)德士（IDEXX）公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)為40959-V931。操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PRRSV抗體檢測(cè)成立條件是陽(yáng)性對(duì)照OD值-陰性對(duì)照OD值≥0.15；陰性對(duì)照OD值≤0.15。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)是S/P值≥0.40；陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)是S/P值＜0.40。

CSFV抗體檢測(cè)試劑盒也是美國(guó)愛(ài)德士（IDEXX）公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)A651。操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，CSFV抗體檢測(cè)成立條件是陰性對(duì)照OD值＞0.500，陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率＞50%。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)是阻斷率≥40%；陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)是阻斷率≤30%；阻斷率在30%～40%之間為可疑。

3.2分子生物學(xué)檢測(cè)

豬場(chǎng)同時(shí)采集3份病料送往華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用RT-PCR、PCR等方法進(jìn)行高致病性和/或經(jīng)典的PRRSV抗原、圓環(huán)病毒2型（PCV2）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟（CSF）的抗原檢測(cè)。

3.3PRRSV的ORF5基因測(cè)序

對(duì)RT-PCR所檢測(cè)到的藍(lán)耳病毒株，擴(kuò)增ORF5基因片段、測(cè)序，并與當(dāng)前流行毒株和目前常用的疫苗毒株進(jìn)行比對(duì)分析。

4　實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

4.1抗體檢測(cè)結(jié)果

豬瘟抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：健康豬抗體陽(yáng)性率為10%，平均阻斷率為26%；發(fā)病豬抗體陽(yáng)性率為40%，平均阻斷率為32%，每頭豬的阻斷率見(jiàn)圖1。

藍(lán)耳病抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示：健康豬抗體陽(yáng)性率為20%，離散度為65%，S/P值為0.48；發(fā)病豬抗體陽(yáng)性率為40%，離散度為72%，S/P值為1.5，其中S/P＞2的30%，S/P＞3的10%，見(jiàn)圖2。

圖1　CFSV抗體阻斷率分析圖

4.2病毒檢測(cè)結(jié)果

PRRSV抗原檢測(cè)的引物是根據(jù)高致病性藍(lán)耳病病毒核酸NSP2基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳后如果僅有508 bp的片段，說(shuō)明只有經(jīng)典毒株的PRRSV感染；如果僅有418 bp的片段，說(shuō)明只有高致病性PRRSV毒株感染；如果同時(shí)能擴(kuò)增出這兩個(gè)片段，說(shuō)明樣品同時(shí)存在經(jīng)典和高致病毒株。送檢的3份病料都是只有418 bp左右的片段，說(shuō)明高致病性PRRSV核酸呈陽(yáng)性，而沒(méi)有檢測(cè)出經(jīng)典的PRRSV（圖3）；圓環(huán)病毒2型的各樣品的PCR產(chǎn)品電泳后出現(xiàn)496 bp的特異性條帶，因此判斷為陽(yáng)性（圖4）；豬瘟抗原（圖5）和偽狂犬野毒（圖6）都是陰性。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2　PRRSV抗體S/P值分析圖

圖3　病料的RT-PCR結(jié)果

圖4　病料的圓環(huán)ORF2基因PCR檢測(cè)

圖5　病料的豬瘟E2基因的RT-PCR結(jié)果

圖6　病料的偽狂犬gE基因的PCR結(jié)果

表1　3份病料的抗原檢測(cè)結(jié)果

樣品中RT-PCR擴(kuò)增出的PRRSV陽(yáng)性條帶的陽(yáng)性毒株，擴(kuò)增ORF5基因序列，并對(duì)其測(cè)序，將核酸序列在NCBI上經(jīng)Blast搜索，并與當(dāng)前流行毒株和目前常用的疫苗毒株進(jìn)行比對(duì)分析，表明該豬場(chǎng)的毒株與高致病性藍(lán)耳病疫苗毒株最為接近，與HuN4-F112株、TJM -F92株、JXA1-R株的同源性分別為98.83%、98.50%、98.17%。而與經(jīng)典的PRRS疫苗株VR2332、R98株的同源性分別是88.17%和88.00%。測(cè)序結(jié)果表明豬場(chǎng)感染的是高致病性藍(lán)耳病。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　藍(lán)耳病病毒主要抗原基因ORF5測(cè)序同源性比較結(jié)果((%%))

5　豬場(chǎng)的防控措施和效果

5.1防控措施

根據(jù)豬場(chǎng)的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，判定該豬場(chǎng)發(fā)病的主要原因是HP-PRRS的感染并伴有PCV2的感染，而沒(méi)有經(jīng)典PRRSV、豬瘟、偽狂犬野毒的感染。但該場(chǎng)一直使用高致病性藍(lán)耳（TJM-F92株）疫苗，經(jīng)與豬場(chǎng)詳細(xì)溝通后，決定從2014年8月1日開(kāi)始全場(chǎng)使用進(jìn)口經(jīng)典毒株P(guān)RRSV疫苗，使用方法如下。

⑴母豬群在使用疫苗前1周，飼料中添加適當(dāng)藥物進(jìn)行保健，主要的藥物是20%替米考星1 kg/噸料+ 20%磺胺間甲氧嘧啶1 kg/噸料，在飼料中再添加適當(dāng)?shù)碾娊舛嗑S。

⑵母豬群首次普免進(jìn)口經(jīng)典毒株P(guān)RRSV疫苗時(shí)，產(chǎn)前一個(gè)月的母豬暫時(shí)不免，待產(chǎn)完仔豬后，在產(chǎn)房和仔豬一同免疫。

⑶母豬群首次免疫后，一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，以后4次/年。

⑷將公豬分為2個(gè)群體，分開(kāi)免疫（間隔3周），免疫后的公豬，3周內(nèi)不要使用其精液。

⑸現(xiàn)有產(chǎn)房中的所有14日齡及以上仔豬免疫進(jìn)口經(jīng)典毒株P(guān)RRSV疫苗1頭份。以后出生的仔豬在14日齡免疫。

同時(shí)加強(qiáng)病豬的隔離淘汰、環(huán)境衛(wèi)生管理工作，嚴(yán)格做好全進(jìn)全出。

5.2防控效果

在豬場(chǎng)免疫經(jīng)典毒株P(guān)RRSV疫苗后3個(gè)月，豬場(chǎng)比較了更換疫苗前后各2個(gè)月的斷奶仔豬數(shù)和保育舍的存活率。更換疫苗前由于保育豬發(fā)病，6～7月的生產(chǎn)成績(jī)不高，在8月初更換藍(lán)耳病疫苗后，豬場(chǎng)的生產(chǎn)成績(jī)有很大提升（表3）。到目前為止，豬場(chǎng)生產(chǎn)成績(jī)一直穩(wěn)定，保育豬成活率達(dá)到97%左右。

表3　豬場(chǎng)更換PRRSV疫苗前后生產(chǎn)成績(jī)的比較

6　分析與討論

對(duì)PRRS患病豬群進(jìn)行活疫苗免疫，是有效控制PRRS危害的重要措施之一，這在全世界范圍內(nèi)都有大量成功的報(bào)道[8,9]。從PRRS美洲株弱毒苗的臨床使用效果可以看出，免疫能夠減輕臨床癥狀，提高生產(chǎn)成績(jī)，對(duì)同基因型變異株和異源毒株有保護(hù)力[10-12]。

在養(yǎng)豬的生產(chǎn)實(shí)際中，當(dāng)懷疑豬群受到藍(lán)耳病感染時(shí)，首先應(yīng)盡快檢測(cè)確診，然后使用疫苗進(jìn)行免疫。但養(yǎng)殖戶在選擇使用哪種疫苗或哪個(gè)廠家的藍(lán)耳病疫苗上，往往無(wú)所適從，因?yàn)槭袌?chǎng)上既有“高致病性”藍(lán)耳病疫苗又有“經(jīng)典”藍(lán)耳病疫苗。當(dāng)前流行一種觀點(diǎn)，即對(duì)豬場(chǎng)的PRRS毒株進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果來(lái)確定選擇使用高致病性變異株疫苗還是使用經(jīng)典毒株疫苗[6]。在PRRSV的基因組中，非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2和結(jié)構(gòu)蛋白ORF5基因由于變異大，是進(jìn)行PRRSV分子流行病學(xué)研究和病毒遺傳變異分析的重要的2個(gè)靶基因。當(dāng)前大部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)PRRSV進(jìn)行基因序列相似性比對(duì)并區(qū)分所謂的“高致病性”或“經(jīng)典”毒株，依靠的正是這兩個(gè)基因。如果檢測(cè)出的毒株在NSP2具有非連續(xù)性的30個(gè)氨基酸的缺失，便屬于是“高致病性”P(pán)RRSV毒株，若相對(duì)應(yīng)部位未出現(xiàn)缺失的就是“經(jīng)典”P(pán)RRSV毒株。豬場(chǎng)內(nèi)流行的PRRS毒株基因與PRRS疫苗毒株的基因序列相似性越高，并不一定意味著它們之間的交叉保護(hù)越好。Tanja等研究發(fā)現(xiàn)PRRS疫苗毒株和野毒株之間ORF5基因序列的相似性，與疫苗的交叉保護(hù)力沒(méi)有直接關(guān)系[13]。如果存在PRRS的基因相似性越高保護(hù)性越好，那么理論上講，用本豬場(chǎng)分離的PRRSV毒株來(lái)免疫本場(chǎng)豬群，效果應(yīng)當(dāng)是最好的。但是美國(guó)Daniel等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用本場(chǎng)的PRRSV毒株（LVI）給本場(chǎng)的豬群進(jìn)行免疫馴化，雖然豬群PRRSV轉(zhuǎn)陰的時(shí)間要比使用商品化的PRRS MLV疫苗快，但是使用PRRS疫苗的經(jīng)濟(jì)效益要好于本場(chǎng)PRRSV（LVI）的免疫[14]。

本文所報(bào)道的豬場(chǎng)，病料中擴(kuò)增出的PRRSV ORF5基因核苷酸序列與我國(guó)分離的高致病性毒株HuN4-F112株、TJM-F92株和JX A1-R株的同源性都在98%以上。在發(fā)病之前一直使用的是高致病性的藍(lán)耳病疫苗TJM-F92株，但還是在保育豬群中發(fā)生高致病性藍(lán)耳病，可見(jiàn)即便使用同基因型的藍(lán)耳病疫苗，也不能做到對(duì)豬群的全部保護(hù)，其原因在于PRRS的防控非常復(fù)雜，疫苗只是控制藍(lán)耳病的措施之一，需要的是綜合防控。該豬場(chǎng)雖然自然防疫條件較好，也非常注重藍(lán)耳病的控制，定點(diǎn)引種并在引入時(shí)進(jìn)行隔離，但還是發(fā)生了藍(lán)耳病，而且歷經(jīng)3、4個(gè)月都沒(méi)有得到理想的控制。分析發(fā)病的原因主要有兩方面：其一還是引種出了問(wèn)題，因?yàn)樵诎l(fā)病的前2個(gè)月（即2014年2月）豬場(chǎng)引進(jìn)了一批后備母豬，這批后備母豬引入時(shí)臨床表現(xiàn)很健康，因條件限制引種時(shí)并沒(méi)有對(duì)這些后備豬進(jìn)行檢測(cè)，它們可能帶毒或處于排毒期。其二是豬場(chǎng)雖然自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出，但因?yàn)閳?chǎng)地限制一直使用的是單點(diǎn)式飼養(yǎng)管理模式，所以發(fā)生藍(lán)耳病時(shí)無(wú)法切斷病毒在場(chǎng)內(nèi)的反復(fù)循環(huán)感染，導(dǎo)致豬場(chǎng)發(fā)病的持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

本文報(bào)告的豬場(chǎng)在受到高致病性藍(lán)耳病病毒感染后，應(yīng)用進(jìn)口經(jīng)典毒株P(guān)RRSV疫苗有效控制了豬場(chǎng)高致病性藍(lán)耳病的野毒攻擊，降低了保育階段的損失，顯著改善了生產(chǎn)成績(jī)。由此案例可看出，“經(jīng)典株”P(pán)RRS疫苗對(duì)高致病性PRRSV變異藍(lán)耳病，也具有良好的免疫保護(hù)效果?！案咧虏⌒浴盤(pán)RRSV毒株的特征是在PRRSV的NSP2基因存在30個(gè)氨基酸缺失，缺失的基因在整個(gè)PRRSV基因序列的占比不到0.6%，其本質(zhì)還是北美株P(guān)RRSV，可以使用所有的北美株P(guān)RRS疫苗。國(guó)內(nèi)外多個(gè)試驗(yàn)也證明IngelvacPRRS MLV疫苗對(duì)多種常見(jiàn)異源PRRSV都是有效的[15-17]。因此當(dāng)豬場(chǎng)發(fā)生檢測(cè)測(cè)序?yàn)椤案咧虏⌒浴盤(pán)RRSV時(shí)既可以使用“經(jīng)典株”P(pán)RRS疫苗，也可以使用安全穩(wěn)定的“高致病性”P(pán)RRS疫苗。另外，此案例說(shuō)明管理在藍(lán)耳病的控制上也起到重要作用。因?yàn)樨i場(chǎng)從2014 年4月發(fā)病開(kāi)始一直到同年10月，都沒(méi)有再引進(jìn)后備豬，這在藍(lán)耳病的控制策略上相當(dāng)于是對(duì)該豬場(chǎng)進(jìn)行了封群。在8月開(kāi)始對(duì)全場(chǎng)母豬

中國(guó)目前流行的藍(lán)耳病毒株，無(wú)論是經(jīng)典的美洲型PRRSV，還是“高熱病”的變異PRRSV，都屬于PRRSV美洲型。進(jìn)口豬藍(lán)耳病活疫苗能夠?qū)Σ煌局旰屯N毒株的攻毒提供交叉保護(hù)。但藍(lán)耳病的防控非常復(fù)雜，合理的使用弱毒疫苗，科學(xué)的豬場(chǎng)管理和嚴(yán)格的生物安全依然很重要[9,18]。

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中圖分類號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4645(2015)04-0028-06

收稿日期：2015-01-21