武 沖，尹燕雷，陶吉寒，楊雪梅，馮立娟

（山東省果樹研究所，山東泰安271000）

鹽漬化地區(qū)林木稀少、土地荒蕪、生態(tài)條件惡化，嚴重制約了當地農林經濟和社會發(fā)展［1］。如今人們越來越重視耐鹽植物的資源調查、耐鹽機制探索、耐鹽植物篩選利用以及耐鹽植物新品種培育的研究［2］。石榴（PunicagranatumL.）屬石榴科（Punicaceae）石榴屬（PunicaL.）植物，其果實具有抗細菌、抗寄生、抗病毒和抗癌等作用，花具有很高的觀賞價值，是集生態(tài)、經濟、社會效益、觀賞價值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹。

石榴是海涂鹽浸土地果樹開發(fā)的先鋒樹種之一，可在含鹽量0.3%左右土壤上正常生長［3］。目前有關石榴的研究重點集中在新品種選育、果實組分分析、果色形成機理等方面［4－7］，而在石榴抗逆性方面研究工作還很薄弱。低溫預處理可以提高種子抗鹽能力已在草本植物中得到多方面的證實［8－10］，而在木本植物種子方面的相關研究很少，目前還沒有關于低溫預處理石榴種子耐鹽萌發(fā)研究的報道。因此，本試驗以山東棗莊主栽石榴品種‘嶧城大青皮甜’種子為材料，研究了低溫預處理石榴種子在鹽脅迫下的萌發(fā)能力、保護酶活性、可溶性蛋白含量、相對電導率等指標響應特征，初步探討石榴種子的抗鹽機理，以期為生產實踐提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為2013年9月底在山東棗莊嶧城采集的‘嶧城大青皮甜’石榴。于2014年1月取出果實內的種子，用紗布反復搓洗干凈備用。種子千粒重28.53g。

1.2 試驗處理

1.2.1 低溫預處理 2014年5月22日開始進行發(fā)芽試驗。將種子用3層濕紗布包裹，置于25℃培養(yǎng)室內進行催芽。催芽時，每天用清水沖洗種子，保證種子萌發(fā)所需水分。2周后，選取籽粒飽滿的種子2 000 粒為一組，1800粒試驗，200粒待用，共4組。用0.5% HgCl2對種子表面消毒10min，之后用清水反復沖洗5 次。將種子放入覆蓋濕紗布的15cm 培養(yǎng)皿中，置于2～4℃低溫下分別處理0（未低溫預處理，CK1）、5、10和15d后用于NaCl脅迫處理。

1.2.2 NaCl溶液處理 試驗設置0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%等6種濃度NaCl溶液處理，以清水作為對照（CK2），3次重復，每重復100粒。在直徑15cm 培養(yǎng)皿中置2層濾紙，先用少量相應濃度NaCl溶液浸潤，將不同處理的石榴種子整齊擺放其中，培養(yǎng)溫度為25℃。在人工培養(yǎng)箱中萌發(fā)25d后取樣測定相關指標。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 發(fā)芽能力指標 參照《國際種子檢驗規(guī)程》［11］公式計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢：

發(fā)芽率（%）＝種子發(fā)芽數／供試種子數×100%

發(fā)芽勢（%）＝發(fā)芽進程當日發(fā)芽最多種子發(fā)芽數／供試種子數×100%

1.3.2 幼苗形態(tài)指標 發(fā)芽試驗結束后，在每個處理3次重復中分別隨機抽取10株幼苗，測其上胚軸和胚根長。

1.3.3 幼苗抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質含量 取各處理已完全展開葉片，立即帶回實驗室進行超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，以及脯氨酸和可溶性蛋白含量的測定。SOD 活性的測定采用NBT 氧化還原法；POD 活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，以上指標的測定方法均參照《植物生理生化實驗原理和技術》［12］。CAT 活性測定采用紫外吸收法；脯氨酸含量的測定用茚三酮法；可溶性蛋白含量測定用考馬斯亮藍G－250染色法，均參照《植物生理實驗指導》［13］。所有指標測定均重復3次，最終結果為試驗平均值。

1.3.4 細胞膜透性 采用電解質外滲電導法測定［14］。稱取0.3g發(fā)芽種子，沖洗干凈，加入10mL去離子水，充分振蕩后靜置24h，采用DDS211型電導率儀測定其電導率初值L1，沸水浴10 min冷卻至室溫，測其電導率終值L2，計算相對電導率，5次重復。

相對電導率（L）＝（L1－蒸餾水電導率）／（L2－蒸餾水電導率）×100%

1.4 數據處理

利用Excel 2007計算各指標的平均值，并繪制圖表，采用SAS 統(tǒng)計軟件中的ANOVA 方法對測量數據進行方差分析，用Duncan法進行多重比較（LSD）［15］。

2 結果與分析

2.1 低溫預處理對鹽脅迫下石榴種子萌發(fā)的影響

由表1可知，隨著鹽濃度升高，各低溫預處理石榴種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均表現出先升高后降低的趨勢，并在0.1%鹽濃度下達到最高值。在0.1%鹽濃度下，石榴種子可以正常萌發(fā)，除低溫處理5d的發(fā)芽勢和發(fā)芽率與對照（CK2）相近外，其它處理均顯著高于CK2；在0.2%鹽濃度下，石榴種子發(fā)芽率除低溫處理5d外均顯著低于CK2，而發(fā)芽勢均與對照（CK2）差異不顯著；但當鹽濃度高于0.3%時，各鹽脅迫處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著低于CK2。在相同濃度鹽脅迫下，各低溫預處理石榴種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢也隨著處理間延長先升后降，并均在處理5d時達到最大。低溫處理5d時，各鹽分梯度下種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢均高于相應未低溫處理對照（CK1）；低溫預處理10d時，鹽濃度低于0.4%處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢也高于相應CK1，其余均低于相應對照，但未達到顯著水平；低溫預處理15d時，各處理種子的發(fā)芽率均低于相應CK1，當鹽濃度低于0.3%時種子發(fā)芽勢也低于CK1?？梢姡蜏靥幚?和10d能顯著提高石榴種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，并以低溫處理5d效果較好，長時間低溫處理則抑制了種子萌發(fā)；石榴種子可以在鹽濃度低于0.2%條件下正常萌發(fā)，當鹽濃度高于0.2%時萌發(fā)受到抑制，且隨著鹽濃度升高抑制作用越顯著；石榴種子在適當的低溫處理（5d）和低鹽脅迫（0.1%）條件下的萌發(fā)力比單一低溫或者低鹽處理更強。

2.2 低溫預處理對鹽脅迫下石榴幼苗形態(tài)的影響

表2顯示，低溫預處理5d時，石榴幼苗胚根、胚軸長度均顯著大于其它處理（P＜0.05）；低溫預處理10d石榴幼苗胚根、胚軸長度稍小于CK1；低溫預處理15d 時，幼苗生長受到抑制，顯著小于CK1。不同鹽濃度處理種子對幼苗胚根、胚軸生長影響差異顯著（P＜0.05）。其中，幼苗胚根、胚軸長度在鹽濃度為0.1%時顯著大于對照CK2，在濃度為0.2%時稍小于對照CK2，而當高于0.3%時顯著小于對照CK2。另外，種子萌發(fā)最重要的是獲得壯苗，根冠比的大小是壯苗的重要標志，根冠比越大，幼苗越壯，反之越弱。表2結果表明低溫處理5d、0.1%的低鹽濃度時石榴幼苗根冠比最大，幼苗健壯?？梢?，低溫處理和低鹽脅迫對石榴幼苗生長有促進作用，但長時間的低溫和高濃度鹽處理對幼苗會造成傷害；幼苗在低溫處理5d和0.1%鹽濃度下的生長比單獨低溫處理或低鹽脅迫條件下更快，即適當低溫處理可以促進石榴種子在低鹽條件下健壯生長。

表1 低溫預處理對鹽脅迫下石榴種子發(fā)芽影響Table1 Effect of pre－chilling treatment on germination of black Punica granatum seeds under salt stress

2.3 低溫預處理對鹽脅迫下石榴幼苗保護酶活性的影響

2.3.1 SOD 活性 由表3可知，在鹽脅迫下，石榴幼苗SOD 活性隨著鹽濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，且各處理幼苗SOD 活性均在鹽濃度為0.3%時達到最大值，說明石榴幼苗在低于0.3%鹽濃度下可以通過提高SOD 活性來適應外界鹽分變化，但當鹽濃度高于0.3%時SOD 活性受到抑制，從而造成鹽害。同時，低溫處理5和10d不同程度地提高了幼苗SOD 活性，增強了石榴種子抗鹽萌發(fā)能力，且在低溫處理5d時與其它處理間差異顯著；低溫處理15d 時，幼苗SOD 活性顯著低于對照CK1，說明長時間的低溫處理對石榴幼苗生長會造成傷害。

2.3.2 POD 活性 各低溫預處理石榴幼苗POD活性均隨鹽濃度的升高呈先升高后下降變化趨勢，并在鹽濃度0.3%時達到最大；在無鹽脅迫條件下（CK2），除低溫處理15d幼苗POD 活性顯著低于其它低溫處理外，而其它低溫處理間無顯著性差異；但在不同濃度鹽脅迫下，幼苗POD 活性在低溫處理5d均顯著大于其它處理，在低溫處理10d與對照CK1差異不顯著，而在低溫處理15d時顯著低于低溫對照。說明在鹽脅迫環(huán)境中，低溫處理5d能顯著增強幼苗POD 活性，但長時間的低溫處理對石榴幼苗生長反而會造成傷害。

表2 低溫預處理對鹽脅迫下幼苗生長的影響Table2 Effect of pre－chilling treatment on seedling growth under salt stress

表3 低溫預處理對鹽脅迫下幼苗保護酶活性的影響Table3 Effect of pre－chilling treatment on SOD，POD and CAT activities under salt stress

2.3.3 CAT活性 在相同低溫預處理時間內，石榴幼苗CAT 活性變化趨勢與SOD、POD 相同，即隨著鹽濃度的升高而先升高后下降，當鹽濃度0.3%時達到最大。低溫處理5d石榴幼苗CAT 活性在各鹽濃度處理下均顯著大于其它低溫處理；低溫處理10d幼苗CAT 活性除在0.3%鹽濃度下顯著高于CK1外，在其余鹽濃度下均與CK1無顯著差異；低溫處理15d幼苗CAT 活性在0.1%和0.3%鹽濃度下顯著低于對照CK1，在其它鹽濃度下均與CK1差異不顯著。

以上結果表明適當時間的低溫處理（5d）可顯著提高石榴幼苗的保護酶活性，但長時間的低溫處理（15d）則降低了幼苗的保護酶活性；石榴幼苗在外界鹽濃度為低于0.3%時可以通過保護酶系統(tǒng)調節(jié)適應鹽脅迫環(huán)境，而當鹽濃度高于0.3%時超出了其保護酶系統(tǒng)的調節(jié)范圍，從而發(fā)生鹽害。

2.4 低溫預處理對鹽脅迫下石榴幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響

在鹽脅迫下，植物體內的可溶性蛋白含量增加，可能有助于提高植物對鹽脅迫適應能力的逆境蛋白合成［16］。由表4知，隨著鹽濃度的升高，各低溫處理石榴幼苗可溶性蛋白含量逐漸增高，并在不同濃度鹽處理間差異顯著（P＜0.05），且大多顯著大于對照CK2。隨預處理時間延長，各鹽濃度處理石榴幼苗的可溶性蛋白含量先降后升，其在低溫處理5d時比CK1不同程度降低，而在低溫處理10d和15d時卻不同程度地增加，但大多未達到顯著水平。即長時間的低溫預處理可以提高石榴幼苗可溶性蛋白的合成。

同時，隨鹽濃度的升高，各低溫預處理石榴幼苗間脯氨酸含量逐漸升高，但鹽濃度低于0.2%的各處理間差異不顯著，而當鹽濃度高于0.3%時顯著增加，尤其在0.4%和0.5%鹽濃度下劇增。隨著低溫預處理時間的延長，各鹽濃度處理石榴幼苗表現出先降后升的趨勢，且鹽濃度越高這種趨勢越明顯；各低溫處理間脯氨酸含量在低鹽濃度脅迫下差異不顯著，當鹽濃度高于0.3%時差異達到顯著水平（P＜0.05）。說明鹽脅迫和低溫刺激促進了石榴幼苗自身脯氨酸的合成，且鹽濃度越高、低溫處理時間越長脯氨酸在石榴幼苗體內積累越多。

2.5 低溫預處理對鹽脅迫下石榴幼苗電導率的影響

植物膜系統(tǒng)會在鹽脅迫下受到影響，對鹽敏感的植物膜系統(tǒng)先遭到破壞［17］。由表5知，各低溫處理石榴幼苗電導率隨著鹽脅迫濃度的升高逐漸增加，其在0.1%和0.2%鹽濃度之間無顯著差異外，而在其它處理間差異顯著（P＜0.05），尤其當鹽濃度為0.5%時，其相對電導率約為對照（CK2）的3倍，說明石榴幼苗膜系統(tǒng)在高鹽濃度下已受到嚴重破壞。同時，各鹽處理石榴幼苗電導率隨低溫處理時間延長先降低后升高，并在預處理5d時達到最低值。在無鹽脅迫下（CK2），低溫預處理5d幼苗相對電導率均顯著小于對照（CK1），而其余低溫處理與CK1均無顯著差異；在0.1%和0.2%鹽濃度時，不同低溫處理間相對電導率差異不顯著；當鹽濃度高于0.3%時，僅低溫處理15d相對電導率顯著高于其余處理，其它處理間差異不顯著。可見，適當時間的低溫處理能增加石榴幼苗抗鹽力，但長時間的低溫處理抑制幼苗在鹽環(huán)境正常生長。

表4 低溫預處理對鹽脅迫下對幼苗可溶性蛋白和脯氨酸的影響Table4 Effect of pre－chilling treatment on soluble protein contents and proline under salt stress

表5 低溫預處理對鹽脅迫下對幼苗電導率的影響Table5 Effect of pre－chilling treatment on conductivity under salt stress

3 討 論

試驗結果表明，適當時間低溫預處理（5d）和低鹽脅迫（0.1%）可以提高石榴種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和幼苗根冠比，有利于壯苗形成；但長時間的低溫處理和高濃度鹽脅迫卻降低種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和根冠比，抑制幼苗生長。另外，低溫處理5d石榴種子在0.2%鹽濃度下可以正常萌發(fā)，說明低溫預處理可以提高石榴種子抗鹽力，0.2%鹽濃度可以作為石榴種子抗鹽萌發(fā)的臨界點。據報道，石榴樹對土壤鹽浸化有較好的適應性，但含鹽量超過0.3%時會導致石榴樹勢減弱、黃化、早衰、發(fā)生凍害嚴重等現象，含鹽量超過0.4%時則會導致根系、枝條韌皮部和木質部以及葉片發(fā)生鹽害死傷［18］。可見，本研究結果與之相似，其可能原因是石榴種子能在低鹽濃度中萌發(fā)，隨著幼樹生長，其抗鹽能力也逐漸增強，但超過一定濃度時也會對樹體造成傷害。

同時，本研究發(fā)現鹽脅迫下低溫預處理石榴幼苗保護酶（SOD、POD、CAT）活性均呈先上升后下降的趨勢，當鹽濃度為0.3%時達到最大。即石榴幼苗在低鹽脅迫下可通過抗氧化酶系統(tǒng)SOD、POD和CAT 活性增強來清除過多自由基，而高鹽脅迫使體內代謝趨于紊亂，體內自由基急劇升高，這在李屬（Prunus）［19］、檉柳（TamarixchinensisLour.）［20］等植物中也得到驗證。同時，石榴在鹽逆境萌發(fā)過程中，低溫處理5d幼苗的SOD、POD 和CAT 活性均比對照有不同程度提高，說明低溫處理石榴種子可以提高石榴幼苗在鹽環(huán)境的適生能力，這一結論與刺槐（RobiniapseudoacaciaL.）種子經低溫處理能抗鹽萌發(fā)結論相同［21］。

另外，植物在失水時產生的一些滲透調節(jié)物質具有脫水保護功能［22－25］，本試驗結果表明隨著鹽濃度的升高，石榴幼苗的滲透調節(jié)物質（可溶性蛋白和脯氨酸）含量也逐漸增加。據報道，大豆（Glycine max）品種Clark和Forrest的耐鹽性與葉片可溶性蛋白、脯氨酸的積累有關［26］；黑麥草在低溫和鹽漬脅迫之間存在“交叉適應”現象，低溫處理3～5d顯著提高了種子萌發(fā)期的抗鹽能力［27］；低溫誘導小麥種子可以促進種子內源激素合成，從而提高種子抗鹽萌發(fā)性［28］。本試驗表明長時間的低溫處理可以提高石榴幼苗滲透調節(jié)物質的合成，而且隨著鹽濃度的升高它們在體內逐漸累積。未經鹽脅迫石榴幼苗的相對電導率在低溫處理間差異顯著，并在低溫預處理5d時顯著低于常溫對照，說明低溫預處理石榴種子可以提高幼苗抗鹽能力。

綜上所述，石榴種子萌發(fā)、幼苗生長及生理生化特性與低溫處理、鹽脅迫關系密切，適當的低溫處理及低鹽環(huán)境可促進種子萌發(fā)。在低鹽環(huán)境下，低溫處理石榴種子幼苗能通過調整自身生長增強幼苗植株的滲透調節(jié)能力，保證植株正常生長所需水分，同時可溶性蛋白和脯氨酸含量的增加，保證幼苗自身保護酶的合成，維持正常的細胞代謝活性；另外，通過降低細胞膜脂過氧化程度，保證細胞膜的完整性等來提高其逆境適應能力，從而有效降低膜脂過氧化對植株的傷害，表現出較強的抗鹽性。本研究表明，石榴種子萌發(fā)前經適度時間的低溫預處理，有利于石榴種子在鹽脅迫下的萌發(fā)和幼苗生長，且低溫處理5d在0.1%鹽濃度環(huán)境中有利于石榴壯苗形成，是生產實踐中可以應用的技術措施。

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