羅勁，陳一強(qiáng)，孔晉亮，黃宏，鄔麗紅，王可，李冰，董必英

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，南寧530021)

下呼吸道煙曲霉菌分離株耐藥性及基因型觀察

羅勁，陳一強(qiáng)，孔晉亮，黃宏，鄔麗紅，王可，李冰，董必英

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸疾病研究所，南寧530021)

目的 探討下呼吸道煙曲霉菌煙曲霉菌耐藥性和基因同源性。方法 從31例下呼吸道煙曲霉菌感染患者的痰液或肺泡灌洗液中分離煙曲霉菌，采用CLSI M38-A2微量液基稀釋法測定其對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、米卡芬凈的敏感性；采用隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)基因分型技術(shù)獲得受試菌株的RAPD指紋圖并進(jìn)行同源性聚類分析。結(jié)果 31株受試煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、米卡芬凈的耐藥率分別為3.2%、12.9%、25.8%、0、0；31株煙曲霉共分為10種基因型(A～J)，其中B型10株，為主要流行型別；其余分別為A型5株，E型3株，F(xiàn)型4株，C、H、I型各2株，D、G、J型各1株。 結(jié)論 下呼吸道煙曲霉菌感染患者煙曲霉菌基因型以B型為主，伏立康唑、卡泊芬凈、米卡芬凈對煙曲霉菌的抑菌效果較好。

煙曲霉菌；耐藥性；基因分型

煙曲霉菌是廣泛存在于環(huán)境中的條件致病菌，主要以分生孢子的形式通過空氣、接觸等方式傳播，容易造成醫(yī)院內(nèi)免疫低下患者深部真菌感染，其中下呼吸道感染最為常見，嚴(yán)重者甚至發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)。目前導(dǎo)致免疫缺陷住院患者獲得性深部真菌感染的病原體中，煙曲霉菌僅次于白色念珠菌，排在第二位[1]。2011年9月～ 2013年8月，我們收治31例下呼吸道煙曲霉菌感染患者?，F(xiàn)分析煙曲霉菌分離株的耐藥性和基因型，以進(jìn)一步明確下呼吸道煙曲霉菌感染的臨床特點，提高其防治水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 31株煙曲霉菌取自31例下呼吸道煙曲霉菌繼發(fā)感染患者，其中從深部晨痰分離出24株，肺泡灌洗液中分離出7株，經(jīng)乳酸酚棉蘭染色鏡下形態(tài)學(xué)及48℃溫度實驗鑒定為經(jīng)典煙曲霉菌?；颊吣?8例、女13例，年齡47～78(61.8±11.2)歲，>50歲者27例。原發(fā)病為慢性阻塞性肺疾病15例，間質(zhì)性肺疾病5例，肺炎4例，肺癌2例，支氣管擴(kuò)張2例，肺膿腫1例，肺結(jié)核1例，哮喘1例。住院時間>3周者29例，靜脈使用應(yīng)用廣譜抗生素>2周者25例，長期靜脈或口服糖皮質(zhì)激素[相當(dāng)于潑尼松0.5 mg/(kg·d)劑量]者18例，接受侵入性操作(包括氣管插管或切開、中心靜脈置管、深部吸痰等)16例，長期機(jī)械通氣11例，合并糖尿病7例，低蛋白血癥(血清白蛋白<35 g/L)5例，合并彌漫性結(jié)締組織病2例。

1.1.2 主要試劑 藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019，由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床微生物檢驗中心提供。Star Spin Fungal DNA Kit真菌基因組提取試劑盒(北京康潤生物科技有限公司)；玻璃珠(Sigma公司)；Premix TaqTMVersion2.0(日本Takara Biotechnology公司)；RPMI-1640粉末(Gibco公司)；MOPS(Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，北京Solarbio公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，中國路橋技術(shù)責(zé)任有限公司)；隨機(jī)引物R108(GTATTGCCCT，北京華大基因科技股份有限公司合成)。

1.1.3 抗真菌藥物 伏立康唑、兩性霉素B、伊曲康唑溶解于DMSO，卡泊芬凈溶解于滅菌水。均配制成32 mg/mL儲存液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過并分裝后，于-80 ℃保存。

1.1.4 儀器設(shè)備 梯度PCR儀(Bio-rad，T100),全自動凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad，Gel Doc XR+),普通型電泳電源(Bio-rad，Powerpac Universal),超微量核酸濃度測定儀(美國Thermo Nanodrop ND-2000)，無菌96孔板(Corning公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙曲霉菌藥物敏感試驗 將31株煙曲霉菌受試菌株復(fù)蘇并轉(zhuǎn)種于PDA斜面，37 ℃孵育72 h，用含0.025%Tween20的PBS液沖洗斜面表面收集孢子，經(jīng)MOPS緩沖后pH為7.0的RPMI-1640重懸孢子，血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)節(jié)使其終濃度為1×105CFU/mL。采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)M38-A2絲狀真菌藥敏指南中的方法測定31株煙曲霉菌對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、米卡芬凈的藥物敏感性。伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B最終濃度范圍為0.03～16 μg/mL，卡泊芬凈、米卡芬凈為0.015～8 μg/mL。伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B的最低抑菌濃度(MIC)定義為肉眼直接觀察到的無真菌生長的最低藥物濃度；卡泊芬凈、米卡芬凈則讀取其最低有效濃度(MEC)，即相對生長對照孔而言出現(xiàn)短、圓而異常分支菌絲時的最低藥物濃度。因CLSI M38-A2方案尚未制定煙曲霉藥物敏感性的判讀折點，參照文獻(xiàn)[2]，以MIC/MEC≤1 μg/mL為敏感，=2 μg/mL為中介，≥4 μg/mL為耐藥。耐藥率=(耐藥菌株數(shù)+中介菌株數(shù))/總菌株數(shù)×100%。

1.2.2 煙曲霉菌基因型分析 采用玻璃珠破壁法和真菌DNA提取試劑盒提取各菌株基因組DNA。從PDA斜面挑取活化后的煙曲霉菌落接種于SDB，置于搖床上于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。4 000 r/min離心去后掉上清，往沉淀中加入1 mL真菌裂解液及6～8粒玻璃珠，漩渦混合儀持續(xù)震蕩20 min后將裂解液轉(zhuǎn)移至2 mL的EP管中，余下操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。提取的煙曲霉基因組DNA用核酸濃度儀檢測濃度及純度。采用隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)基因分型技術(shù)獲得受試菌株的RAPD指紋圖并進(jìn)行同源性聚類分析。經(jīng)條件優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中Premix Taq 25 μL，煙曲霉基因組DNA模板2 μL，引物R108(10 pmol/ mL)4 μL，滅菌蒸餾水19 μL。RAPD-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL，于含0.5 g/μL溴乙啶的1.5%瓊脂糖中電泳(5 cm/V)，凝膠成像儀上觀察分析條帶。將凝膠成像儀上獲取的DNA指紋圖導(dǎo)入Crosschecker 2.91軟件分析識別電泳條帶，并核對及手工校正軟件自動識別錯誤的條帶，導(dǎo)出一個含有0和1數(shù)據(jù)矩陣的.NTS文件。將.NTS文件導(dǎo)入NTSYS pc 2.10軟件計算相似系數(shù)，并用UPGMA法進(jìn)行同源性聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性 受試的31株煙曲霉對兩性霉素B耐藥率為25.8%，對伏立康唑、伊曲康唑的耐藥率分別為3.2%、12.9%，無對卡泊芬凈、米卡芬凈耐藥菌株，詳見表1。

2.2 煙曲霉菌基因型及同源性 31株下呼吸道分離煙曲霉菌株經(jīng)隨機(jī)引物R108擴(kuò)增，均可產(chǎn)生指紋圖譜(分型率100%)，擴(kuò)增DNA的片段數(shù)為1～7，最小片段約為200 bp，最大片段為2 000 bp，所有菌株在1 000 bp處均可產(chǎn)生特征性條帶(見圖1)。經(jīng)NTSYS pc 2.10聚類分析，根據(jù)圖譜情況及專業(yè)知識，以相似系數(shù)>0.8作為判定同型菌株的標(biāo)準(zhǔn)，31株菌分為A～J共10種基因型，其中B型10株，為主要流行型別；A型5株，E型3株，F(xiàn)型4株，C、H、I型各2株，D、G、J型各1株(見圖2)。

圖1 31株受試煙曲霉菌的RAPD指紋圖譜

圖2 31株受試煙曲霉菌的聚類分析樹狀圖

3 討論

三唑類藥物伏立康唑、伊曲康唑，多烯類藥物兩性霉素B及其脂質(zhì)體以及棘白菌素類藥物卡泊芬凈及米卡芬凈等均為煙曲霉菌感染的主要治療藥物。近年來有報道已經(jīng)出現(xiàn)煙曲霉菌交叉耐藥及多重耐藥菌株[6]。研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌若在感染者體內(nèi)形成生物被膜，則菌體在胞外基質(zhì)的包被下，對抗真菌藥物的敏感性明顯降低[4]，常規(guī)劑量常不能達(dá)到治療效果。本研究31株受試煙曲霉菌對兩性霉素B的耐藥率為25.8%，與全球抗生素監(jiān)測項目報道的28.6%[7]接近，主要是因為耐藥菌株可在周圍環(huán)境廣泛存在并通過空氣、接觸、候鳥遷徙等途徑向世界各地傳播[8]。兩性霉素B及其脂質(zhì)體為傳統(tǒng)治療IPA等下呼吸道煙曲霉菌感染的首選藥物，但不良反應(yīng)較多且耐藥率較高。目前多以不良反應(yīng)相對較少、敏感性較好的三唑類藥物，例如伏立康唑作為首選[9]。國內(nèi)外文獻(xiàn)報道煙曲霉菌對三唑類藥物耐藥率為0～6.0%[10]，本研究受試煙曲霉菌對伏立康唑、伊曲康唑耐藥率分別為3.2%、16.1%，且三唑類耐藥菌株MIC值處于中介或較低耐藥水平，不存在交叉耐藥菌株。伊曲康唑的耐藥率偏高，可能是由于本地區(qū)部分基層醫(yī)院以伊曲康唑進(jìn)行預(yù)防性或經(jīng)驗性治療有關(guān)，因此有必要對伊曲康唑藥物敏感性進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。同時應(yīng)規(guī)范基層醫(yī)院抗真菌藥物的使用，及時進(jìn)行體外藥敏試驗以指導(dǎo)臨床用藥。本研究中31株受試菌株對卡泊芬凈及米卡芬凈的敏感率達(dá)100%，符合目前文獻(xiàn)報道棘白菌素類耐藥的煙曲霉菌株僅為極少數(shù)FKS1基因突變的實驗菌株，尚未發(fā)現(xiàn)臨床分離的耐藥菌株[11]的結(jié)論，這可能與該類藥物為近年剛上市的新藥，價格相對昂貴，僅用于治療危重或挽救不能耐受其他藥物的IPA患者有關(guān)。棘白菌素類抗真菌藥物毒性低，且不與其他抗真菌藥物產(chǎn)生拮抗，因此在聯(lián)合用藥治療下呼吸道煙曲霉菌感染方面具有很廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)生下呼吸道煙曲霉菌感染的患者可作為感染源，病原體通過空氣或接觸傳播等途徑，造成病房內(nèi)其他有感染危險因素尤其免疫力低下的患者感染煙曲霉菌，甚至造成煙曲霉菌院內(nèi)感染暴發(fā)流行。用簡易可靠的基因分型方法對煙曲霉菌株的同源性及其他分子流行病學(xué)特征進(jìn)行分析，有助于控制并阻止病原體傳播。RAPD技術(shù)是一種DNA指紋圖譜多態(tài)性分析方法，不僅具有常規(guī)PCR技術(shù)快速、靈敏、簡便、分型率高等特點，而且由于其引物具有通用性，不需預(yù)先知道靶基因的核苷酸序列，目前在分子流行病學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。本研究31株煙曲霉菌共分為10種基因型，呈現(xiàn)出較為明顯的多態(tài)性，與空氣或某些物品的流通以及探視人員來往頻繁，將外界環(huán)境中不同基因型的菌株帶入醫(yī)院病房內(nèi)有關(guān)。應(yīng)應(yīng)嚴(yán)格病房管理，盡量減少探訪，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員的消毒隔離觀念。本研究基因型分型結(jié)果顯示，為B型煙曲霉菌為主要流行型別。同一病區(qū)存在多于2株以上來自不同患者的同源菌株感染，高度提示存在該菌株引起的醫(yī)院感染在局部爆發(fā)流行的可能，應(yīng)及時采取干預(yù)措施，阻斷其進(jìn)一步發(fā)展。本研究基因型為B型的7、8、9號菌株分離自同一時期在同一病區(qū)住院的3例患者，提示可能發(fā)生該型菌株的交叉感染。16、24、29、30號菌株相對應(yīng)的4例患者在較長一段住院時間內(nèi)序貫發(fā)生同一RAPD型別的煙曲霉菌感染，其中16號菌株感染的患者最先發(fā)生肺部煙曲霉菌感染，其病程覆蓋了其他幾位患者的發(fā)病時間，因此該患者很可能是造成后續(xù)幾例患者感染的源頭?；仡櫜∈焚Y料發(fā)現(xiàn)，該患者臨床診斷為支氣管擴(kuò)張合并肺曲霉球病，此類患者肺局部形成帶被膜的肺曲霉球[12]，可作為潛在的慢性感染源。因此應(yīng)盡量將該患者安排至層流隔離病房密切觀察病情，妥善處理其呼吸道分泌物及醫(yī)療用物，同時積極治療其肺部的煙曲霉菌感染灶，對其進(jìn)行醫(yī)療護(hù)理操作前后應(yīng)做好手部清潔，防止菌株通過接觸途徑傳播。

綜上所述，臨床上應(yīng)對有下呼吸道煙曲霉菌感染危險因素的呼吸內(nèi)科住院患者采取積極有效的預(yù)防措施，臨床用藥應(yīng)以藥物敏感性試驗結(jié)果作為指導(dǎo)。RAPD基因分型技術(shù)在早期發(fā)現(xiàn)感染源，預(yù)防和監(jiān)控院內(nèi)煙曲霉感染方面具有較好的實用價值和可行性。

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·作者·編者·讀者·

更正

我刊2013年第53卷46期刊登的《Toll樣受體4與糖尿病腎病的關(guān)系研究進(jìn)展》一文通信作者為陸衛(wèi)平，第一作者單位是南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院。基金項目是國家自然科學(xué)基金青年項目(81200595)。

本刊編輯部

Antifungal susceptibility and genotyping analysis of aspergillus fumigatus caused lower respiratory tract infection

LUOJing，CHENYi-qiang，KONGJin-liang，HUANGHong，WangKe，LIBing,DONGBi-ying

(InstituteofRespiratoryDisease，F(xiàn)irstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To study the resistance and homology of aspergillus fumigatus that caused lower respiratory tract infection. Methods The 31 clinical strains of aspergillus fumigatus were respectively isolated from the sputum and bronchoalveolar lavage fluid of patients who suffered from lower respiratory tract aspergillus fumigatus infection . The susceptibility of five antifungal agents against aspergillus fumigatus was measured by liquid microdilution method and the homology of strains was analyzed with random amplified polymorphic DNA(RAPD)assay. Results The resistance of the 31 tested aspergillus fumigatus strains was 3.2% to voriconazole，12.9% to itraconazole，25.8% to amphotericin B whereas all sensitive to caspofungin and micafungin. By RAPD，the 31 strains were divided into 10 genotypes(A～J)，among which Type B was the major prevalent genotype that consisted of 10 strains. Conclusions The genotype B was proved to be the relevant type that caused lower respiratory tract aspergillus fumigatus infection in the surveyed hospital.Voriconazole，caspofungin，micafungin exhibited favorable antifungal activity against Aspergillus fumigatus isolates in vitro.

aspergillus fumigatus； drug resistance； genotyping

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260002)。

羅勁(1989-)，男，在讀碩士研究生，研究方向為肺部感染性疾病的基礎(chǔ)研究。E-mail：66875350@qq.com

陳一強(qiáng)(1959-)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向哮喘、肺栓塞及肺部感染性疾病的基礎(chǔ)研究。E-mail：chenyq2013@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.005

R563.1

A

1002-266X(2015)06-0014-04

2014-11-18)