程 倩 吳紅崑

原發(fā)性高血壓(Primary Hypertension)是老年人較常見的心血管疾病，由于年齡增長、飲食結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境的改變，老年群體中的高血壓患病率不斷增高。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是以菌斑微生物為始動(dòng)因子，發(fā)生在牙周支持組織的慢性感染性疾病。研究結(jié)果表明[1]：調(diào)整了性別、年齡、糖尿病、吸煙指數(shù)、體重指數(shù)和血膽固醇含量等因素后，多因素分析結(jié)果顯示：牙周病與心血管疾病發(fā)病率呈正相關(guān)，牙周病是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。目前，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病與牙周炎的關(guān)系，國內(nèi)外關(guān)注較多，但有關(guān)高血壓與牙周炎的研究較少，有待進(jìn)一步深入研究?？谇簧鷳B(tài)系統(tǒng)是一個(gè)由大量微生物組成的復(fù)雜龐大的生態(tài)系統(tǒng)，在700 多種可檢出的口腔細(xì)菌中，只有不到50%的細(xì)菌可以在體外培養(yǎng)[2]。區(qū)別于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法， 以PCR 為基礎(chǔ)的高通量方法如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，可以不必對(duì)原始樣本進(jìn)行培養(yǎng)而直接提取基因組DNA，分析細(xì)菌群體在基因水平和代謝水平上的多樣性，監(jiān)測微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，以及發(fā)現(xiàn)新的口腔微生物物種等[3]。本研究通過PCR-DGGE 技術(shù)初步分析不同牙周狀況的老年高血壓人群唾液微生物多樣性變化，比較其微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

1. 材料和方法

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 總納入標(biāo)準(zhǔn) 65-80 歲，身體、精神發(fā)育正常，剩余牙數(shù)不少于18 顆，無長烤瓷橋修復(fù)；至少3 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素及免疫抑制劑，6個(gè)月內(nèi)未接受任何牙周治療；除牙周炎外無其他明顯口腔感染性疾病，除單純原發(fā)性高血壓外無其他系統(tǒng)性疾病。

1.1.2 牙周炎患者納入標(biāo)準(zhǔn)[4]臨床診斷為慢性牙周炎；至少4 個(gè)位點(diǎn)牙周探診深度(PPD)＞5mm；至少4 個(gè)位點(diǎn)臨床附著喪失(CAL)＞3mm；至少4 個(gè)位點(diǎn)X 線片顯示明顯牙槽骨吸收。

1.1.3 高血壓患者納入標(biāo)準(zhǔn)[5]確診為單純原發(fā)性高血壓：非同日在息靜及非藥物狀態(tài)下，3 次測得血壓平均值超過世界衛(wèi)生組織統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，即收縮 壓SBP ≥140mmHg 和/ 或 舒 張 壓DBP ≥90mmHg；血壓控制范圍：( 140-180)/ (90-110)mmHg；排除繼發(fā)性高血壓患者；未并發(fā)糖尿病和其它心血管疾病。

1.2 樣本采集 向受試者交代該實(shí)驗(yàn)的目的、過程、風(fēng)險(xiǎn)、收益及退出機(jī)制等，確保理解全部內(nèi)容，待受試者簽訂知情同意書后取樣。分為高血壓伴慢性牙周炎患者(組HN+CP ，5 例)、全身健康慢性牙周炎患者(組CP ，5 例)、口腔健康高血壓患者(組HN ，5 例)和健康對(duì)照(組N ，4 例)4 組。早8 時(shí)空腹自然口含唾液數(shù)分鐘后，由同一名操作者將滅菌EP 管置于受檢者下唇口腔黏膜，使唾液自然流入，收集4 組人群刷牙后12 小時(shí)非刺激性唾液樣本3ml，冷藏，-80℃保存。

1.3 唾液細(xì)菌總DNA 提取 使用試劑盒MasterPureTM DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies) 提取唾液樣本中的細(xì)菌基因組DNA，-20℃儲(chǔ)存。

1.4 PCR 擴(kuò)增 使用DreamTaqTM PCR Master Mix 試劑盒對(duì)基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rDNA 基因V3 區(qū)，得到目標(biāo)片段約為300bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。引物設(shè)計(jì)為不同種類細(xì)菌的擴(kuò)增通用引物：上游引物5' CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3' ，下游引物5' -GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C -3' 。1%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

1.5 變性梯度凝膠電泳 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過DCodeTM Universal Mutation 檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules， CA，USA)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。變性劑梯度為40%-60%，電壓恒定為60V，溫度60℃電泳過夜，約16h 后，溴化已錠(EB)染色10min，漂洗10min，于膠成像系統(tǒng)中成像。

1.6 條帶回收測序 切下凝膠上的特征條帶，送北京六合華大基因科技股份有限公司克隆、測序。測序結(jié)果利用美國國立衛(wèi)生研究院GenBank數(shù)據(jù)庫Nucleotide blast 程序進(jìn)行序列比對(duì)分析，找出其相似度最高的微生物種屬。

1.7 DGGE 圖譜分析 采用Quantity One 1-D 分析軟件4.6.2(Bio-Rad 公司， 美國)對(duì)電泳圖像進(jìn)行分析。對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行優(yōu)化處理后，識(shí)別、調(diào)整泳道及條帶，進(jìn)行條帶配對(duì)，對(duì)圖譜中的條帶進(jìn)行半定量分析。采用豐富度(S)和Shannon-Weaver 指數(shù)(H’)反應(yīng)群落多樣性。多樣性數(shù)據(jù)使用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行方差分析(ANOVA)。

2. 結(jié)果

2.1 DGGE 指紋圖譜 DGGE 指紋圖譜顯示4 組樣本唾液微生物群落組成豐富，組間條帶結(jié)構(gòu)存在多樣性和差異性(圖1)。

2.2 多樣性分析 采用豐富度(S)和Shannon-Weaver 指數(shù)(H’)來分析4 組人群的多樣性(表1)。物種豐富度(species richness， S)是指群落所包含的物種數(shù)目，表明群落或生境中物種數(shù)目的多寡。本實(shí)驗(yàn)中豐富度以泳道中所有條帶數(shù)目表示。Shannon 指數(shù)的算法采用如下公式：H' =-∑piln(pi)， (pi=ni/ N)，其中ni 為單個(gè)條帶的光密度，N 為所有條帶的光密度[6]。

(1)組間條帶數(shù)目(S)存在顯著差異(P=0.000)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)：

組HN+CP 與組HN 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.000；

組HN+CP 與組N 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.007；

組CP 與組HN 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.001。

圖1 PCR-DGGE 圖譜

表1 4 組樣本多樣性(±s)

表1 4 組樣本多樣性(±s)

HN+CP CP HN N S 12.6±2.1 15.6±1.5 22.6±3.2 18.5±4.0 H' 0.896±0.091 0.978±0.104 1.119±0.090 1.06±0.094

(2) 組間Shannon 指數(shù)(H’)存在顯著差異(P=0.012)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)：

組HN+CP 與組HN 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.002；

組HN+CP 與組N 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.021；

組CP 與組HN 相比減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P=0.034。

2.3 條帶類型分析 共發(fā)現(xiàn)36 種不同類型的條帶(圖2，Band type 1-36)。6 個(gè)條帶(Band type 3、13、22、28、29、31)在約80%以上的樣本中均有出現(xiàn)，其中Band type 29 的檢出率為100%，提示上述微生物不隨全身和牙周狀況的變化而改變。5 個(gè)條帶(Band type 2、14、15、35、36)在約半數(shù)的非牙周炎組(組HN 和組N)中檢出，在牙周炎組(組HN+CP 和組CP)未檢出，其中Band type 14在75%的健康對(duì)照組(組N)中檢出，其他組鮮見；Band type 1 在單純高血壓組(組HN)的檢出率為80%，其他組鮮見；Band type 26 在高血壓組(組HN+CP 和組HN)的檢出率(70%)高于非高血壓組(組CP 和組N)(22%)；提示在不同血壓和牙周狀況下，唾液群落構(gòu)成發(fā)生改變。

圖2 條帶類型分析(綠色(+)代表存在，紅色(-)代表不存在)

2.4 測序及比對(duì)結(jié)果 選擇具有代表性的條帶Band type1、3、14、29(對(duì)應(yīng)圖1 中A、B、C、D)，切膠回收后送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序，測得結(jié)果使用NCBI GenBank 在線BLAST 同源性搜索程序進(jìn)行比對(duì)，以同源性最高的序列來確定同源性信息(表2)。

表2 測序比對(duì)結(jié)果

3. 討論

高血壓和慢性牙周炎在老年人中發(fā)病率高，均是復(fù)雜的多因素疾病。近年來的研究通過口腔微生物將二者聯(lián)系起來，有學(xué)者將牙周炎稱為是一種系統(tǒng)的慢性低度感染條件[7]，而高血壓是一種促炎狀態(tài)。Moise 等[8]應(yīng)用DNA-DNA 棋盤雜交技術(shù)對(duì)11 種齦下細(xì)菌的檢測發(fā)現(xiàn)，齦下牙周致病菌水平與SBP/ DBP 的升高及高血壓患病率直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)4 個(gè)差異條帶中A 為未獲培養(yǎng)細(xì)菌；B 簡明彎曲菌(Campylobacter concisus)在約80%以上樣本中均有出現(xiàn)，可分離自牙齦炎和牙周炎患者的齦溝，但其在口腔的定植及致病性尚不清楚[9]；C 韋榮菌屬(Veillonella sp.)在大部分健康對(duì)照組中檢出，與Paster 等[10]的觀點(diǎn)相一致；牙周炎相關(guān)的D變黑普氏菌(Prevotella nigrescens)在所有樣本中均有檢出，說明該菌是口腔正常菌群的一部分，當(dāng)菌群失調(diào)、口腔生態(tài)平衡被打破時(shí)即成為條件致病菌。

研究發(fā)現(xiàn)，大量與慢性牙周炎相關(guān)的致病菌均能在唾液中檢出[11]；慢性牙周炎患者唾液中某些主要致病菌如齒垢密螺旋體的檢出較健康人高[12]；牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體在唾液和齦下菌斑中的檢出率無顯著差異，而變黑普雷沃菌在唾液中的檢出率高于齦下菌斑[13]。唾液作為口腔微生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，與口腔各個(gè)位點(diǎn)相溝通，是細(xì)菌的天然運(yùn)載介質(zhì)，并提供牙菌斑生物膜形成的環(huán)境，其組成和波動(dòng)可以直接或間接地反映口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，與口腔感染性疾病如齲病和牙周病關(guān)系密切。同時(shí)，唾液取樣簡單，無痛，具有無創(chuàng)性，操作者無需特殊訓(xùn)練，唾液檢測有望成為一項(xiàng)新而簡便的口腔健康狀況監(jiān)測和治療效果評(píng)估手段[14]。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)老年高血壓患者的唾液微生物群落進(jìn)行總體初步分析，提示高血壓患者在保證口腔健康的前提下，其唾液微生物種類多樣性可不發(fā)生明顯改變，口腔唾液菌群可保持其生態(tài)平衡狀態(tài)；而高血壓是一種促炎狀態(tài)，當(dāng)高血壓患者的牙周組織同時(shí)存在炎癥時(shí)，高血壓可導(dǎo)致炎癥加重，進(jìn)而造成口腔整體生態(tài)平衡被打破，某些具有致病潛力的細(xì)菌繁殖占優(yōu)勢，從而抑制、替代了其他細(xì)菌的生長，造成其多樣性降低。

必須指出的是：多數(shù)高血壓患者需終身服藥，且存在聯(lián)合用藥，抗高血壓藥物對(duì)唾液微生物群落的影響尚需進(jìn)一步研究以明確其機(jī)制；老年人的義齒佩戴情況，BMI 指數(shù)，血膽固醇含量，牙周炎的嚴(yán)重程度等因素也應(yīng)考慮在內(nèi)，有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，因擴(kuò)大樣本量后會(huì)導(dǎo)致不同帶型的DGGE 圖譜，且多張圖譜比較會(huì)增加誤差且出現(xiàn)條帶共聚現(xiàn)象[15]，本實(shí)驗(yàn)僅為初步探討。DGGE 技術(shù)在鑒定菌種方面較傳統(tǒng)培養(yǎng)方式具有明顯的優(yōu)勢，能夠全面地反映微生物整體群落信息，從而對(duì)群落組成整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。但是該技術(shù)難以精確分析細(xì)菌代謝活性、數(shù)量和基因表達(dá)水平方面的信息[16]，再結(jié)合其他方法， 可使其對(duì)微生物的研究更加深入。

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