劉 娜 李 華 張 洋 劉洪臣

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織再生修復(fù)的重要種子細(xì)胞[1]。但大量研究結(jié)果表明在慢性牙周炎的侵襲作用下牙周組織再生修復(fù)能力明顯下降[2，3]，如何促進(jìn)牙槽骨再生是目前牙周炎導(dǎo)致的牙周組織損傷修復(fù)研究的熱點(diǎn)。 干細(xì)胞參與組織再生受多種分子信號(hào)通路的調(diào)控，Wnt 通路在牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wnt 信號(hào)通路分為經(jīng)典及非經(jīng)典兩種形式。目前在干細(xì)胞參與成骨分化的過程中研究較多的為Wnt / β-catenin 經(jīng)典信號(hào)通路，非經(jīng)典Wnt / 鈣離子(Wnt / Ca2+)通路主要由Wnt5a 和Wnt11 激活，可能通過G 蛋白激活PLC(Phos pholi pase C)和PKC (Proteinkinase C)，從而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號(hào)成分的激活，以調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞粘著性。此外，Wnt/ Ca2+信號(hào)通路可以激活CaMKII 進(jìn)而活化轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β 活化激酶1(TAK-1)-NLK；NLK可以使TCF/ LEF 磷酸化，可以阻止β-catenin-TCF/ LEF 復(fù)合體綁定DNA 進(jìn)而抑制β-catenin-TCF/ LEF 復(fù)合體活化基因的轉(zhuǎn)錄[4]。

最新研究顯示，不同類型Wnt 通路分子在干細(xì)胞的定向分化過程中具有不同作用。Wnt1，wnt3a 的表達(dá)導(dǎo)致wnt 經(jīng)典信號(hào)通路的增強(qiáng)由此可以導(dǎo)致MSC 礦化能力受阻[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)Wnt4 通過激活非β-catenin 通路(主要是Wnt/Ca2+與Wnt/ PCP 通路聯(lián)合作用)，促進(jìn)MSCs 向成骨細(xì)胞分化，在顱面部和牙周缺損模型中表現(xiàn)出強(qiáng)勁的骨形成能力，促進(jìn)缺損修復(fù)[6]。但炎癥微環(huán)境影響牙周膜干細(xì)胞成骨分化的過程中是否有Wnt 非經(jīng)典信號(hào)通路的參與，目前相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)擬體外獲取慢性牙周炎組織來源的PDLSC并探討非經(jīng)典Wnt/ Ca2+信號(hào)通路在其成骨分化過程中的作用機(jī)制。

1. 材料方法

1.1 材料 胎牛血清，α-MEM 培養(yǎng)基，Ⅰ型膠原(Gibco BRL)；0.25%胰蛋白酶(Sigma， St Louis， MO， USA)；青鏈霉素(Gibco BRL)；鏈霉素(Gibco BRL)；實(shí)時(shí)定量PCR 儀IQ 5(美國(guó))；RNA 抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Fermentas(美國(guó))；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和引物上海生物工程公司(中國(guó))； Syber Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒Takara(日本)。Western 及IP 裂解液，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)；CaMKII抗體NLK 抗體(Millipore，美國(guó))；Runx 2 抗體ALP 抗體(Abcam，美國(guó))；β-Actin，羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。

1.2 離體牙樣本收集 收集因治療需要拔除的健康以及慢性牙周炎病例樣本。正常牙周膜組織來源于因正畸需要拔除的無齲前磨牙及第三磨牙；炎癥牙周膜組織來源于慢性牙周炎患者，慢性牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Armitage 的推薦標(biāo)準(zhǔn)[6]：X 線片顯示牙槽骨吸收達(dá)到牙根2/ 3，一個(gè)以上的牙周袋探診深度≥5mm。所有納入個(gè)體均無系統(tǒng)性疾病及已知的可以影響牙周狀況的疾病，無吸煙史，近6 個(gè)月無特殊服藥史。所有組織樣本均來自于解放軍總醫(yī)院口腔科，項(xiàng)目在患者知情同意的條件下進(jìn)行。

1.3 牙周膜干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 正常組織來源牙周膜干細(xì)胞H-PDLSCs 及炎癥組織來源牙周膜干細(xì)胞P-PDLSCs 的體外培養(yǎng)遵循本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)步驟[7]。在超凈工作臺(tái)將拔除后的牙齒經(jīng)0.01mol/ L PBS 沖洗5-7 次后，用冠根單向刮取根中/ 下三分之一的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，Ⅰ型膠原酶消化15min 后，離心管內(nèi)的組織離心800r/ min。棄上清后重懸并放置在6 孔板中(含15%、胎牛血清)、100μm/ L 抗壞血酸、0.292mg/ ml 谷氨酰胺、100units/ ml 青霉素/ 鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基)。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)5-8d，直至有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%匯合時(shí)用胰酶/ EDTA(0.25/ 0.1，pH=6.4)消化傳代，標(biāo)記為第一代。采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人正常及炎癥組織來源的牙周膜干細(xì)胞，取3-4 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 成骨誘導(dǎo)試驗(yàn) 將多克隆來源的P-PDLSCs 和H-PDLSCs 制成細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/ ml 的密度接種于6 孔板中，用10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)24h，待細(xì)胞伸展至60%-70%匯合后換礦化誘導(dǎo)液(含5mmol/ L β-甘油磷酸鈉，50μg/ ml 維生素C， 1×10-8mol/ L 地塞米松、10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)，每隔3d 換液一次，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行觀察培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞免疫化學(xué)熒光染色 將生長(zhǎng)狀況良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3 代單克隆培養(yǎng)獲得的H-PDLSCs 及P-PDLSCs 調(diào)整密度至5×103/ cm2密度接種至24 孔板，37℃、5%CO2、95%空氣條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后PBS 沖洗兩遍，將H-PDLSCs 及P-PDLSCs 各設(shè)置兩組，一組常規(guī)換液作為對(duì)照，而另一組則加入成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)3d 后4%多聚甲醛常溫固定40min，PBS沖洗3 遍，0.25%TritonX100， 37℃孵育20min，加入相應(yīng)一抗，CaMKII(Millipore， USA)一抗?jié)舛葹?∶100，避光滴加FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗(Pierce， USA；1 ∶800)，孵 育 完 成 后，Hoechst 33342(50g/ ml， Sigma)襯染細(xì)胞核15min。熒光顯微鏡下觀察，用DP controller(Olympus)和DP manager 軟件處理圖像。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè) 將H-PDLSCs 及P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)液7d 后用Trizol 裂解并提取總RNA，測(cè)定RNA 濃度，分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 利用Syber Green 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)體系均為20μl 。引物序列：CaMKII(Ca2+/ 鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶Ⅱ)：fo rward5' -CGCCCGGCACCCGGGGTGCGC-3' ， reverse 5' -CAGAGGAGCACCGAGCCTTC-3' ； NLK (Nemo

樣激酶）：forward5' -AGGCTCCTGAGAATCAACCCAAC-3' ， reverse5' -CCACGGTAATTGACCAACCTCTG-3' ；Runx2(Runt 相關(guān)因子2)：forward: 5' -CCCGTGGCCTTCAAGGT-3' ， reverse: 5' -CGTTACCCGCCATGACAGTA-3' ；β-Actin：orward5' -TGGCACCCAGCACAATGAA-3' ，reverse 5' -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' 。反 應(yīng) 條 件: 95℃變 性20min， 95℃30s， 60℃1min， 40 個(gè) 循 環(huán)。IQ5 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀監(jiān)測(cè)記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)計(jì)算后得出。驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

1.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液試劑盒分別提取對(duì)照組及成骨誘導(dǎo)7d 組P-PDLSCs 與H-PDLSCs 的總蛋白，測(cè)定蛋白樣本濃度，制備蛋白樣品。配置10%的分離膠、6%的濃縮膠和1×SDS 電泳液，依據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行蛋白上樣，電壓為80V，電泳20min待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓至120V，電泳60min。隨后將凝膠中的蛋白在轉(zhuǎn)移電泳槽(200 mA， 2h) 中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF) 膜。用TBST 配制的含有5%脫脂奶粉的封閉緩沖液對(duì)PVDF 膜封閉2h，PVDF膜封閉一抗Runx2、ALP、CaMKII、NLK(1∶1000)稀釋，以β-Actin 為內(nèi)參，4℃過夜。次日取出封有一抗的PVDF 膜，復(fù)溫1h TBST 洗膜，每次5min，共計(jì)3 次。按說明書加入相應(yīng)濃度的二抗，室溫條件下封閉2h。TBST 洗脫二抗，每次10min，共計(jì)3 次。漂洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑盒顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。采用ImageJ 對(duì)WB 檢測(cè)正常及炎癥微環(huán)境中PDLSCs 成骨分化過程中關(guān)鍵成骨蛋白及Wnt 非經(jīng)典信號(hào)通路蛋白水平灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05 差異有顯著性。進(jìn)行多組間比較時(shí)，P值進(jìn)行Bonferroni 校正。

2. 結(jié)果

2.1 H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)3d后免疫熒光檢測(cè)胞漿內(nèi)CaMKII 的表達(dá) 我們將H-PDLSCs 與P-PDLSCs 接種于24 孔板細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3d，顯微鏡下檢測(cè)Wnt/ Ca2+信號(hào)通路細(xì)胞漿內(nèi)中游途徑關(guān)鍵蛋白CaMKII 的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示未經(jīng)誘導(dǎo)的H-PDLSCs 與P-PDLSCs 對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)CaMKII，結(jié)果圖示中紅色熒光表達(dá)即為CaMKII。在成骨誘導(dǎo)液的作用下無論H-PDLSCs還是P-PDLSCs 細(xì)胞漿內(nèi)的CaMKII 的熒光表達(dá)強(qiáng)度較其各自對(duì)照組增強(qiáng)(圖1)。

圖1 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CaMKII 的表達(dá)。細(xì)胞放大倍數(shù)×200

2.2 正常及炎癥組織來源PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7d 后Wnt 非經(jīng)典通路關(guān)鍵基因及成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)條件下CaMKII 在H-PDLSCs 與P-PDLSCs 中的表達(dá)不存在顯著性差異，當(dāng)成骨誘導(dǎo)后H-PDLSCs 與P-PDLSCs 中CaMKII 的表達(dá)量顯著增高，其中H-PDLSCs 增高比例為5.5876 倍，而P-PDLSCs的增高比例為3.78 倍(圖2A)。NLK 是細(xì)胞核內(nèi)的一種關(guān)鍵基因可影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，常規(guī)培養(yǎng)條件下P-PDLSCs 中NLK 的表達(dá)水平顯著高于H-PDLSCs，成骨誘導(dǎo)后兩種組織來源細(xì)胞中NLKmRNA 的表達(dá)水平均有顯著性升高但H-PDLSCs 組顯著高于P-PDLSCs 組(圖2B)。Runx2 的檢測(cè)結(jié)果與我們前期試驗(yàn)結(jié)果一致成骨誘導(dǎo)后H-PDLSCs 組顯著高于P-PDLSCs 組(圖2C)。

圖2 成骨誘導(dǎo)7 天后Real Time PCR 檢測(cè)檢測(cè)CaMKII(A)、NLK(B)和Runx2(C)表達(dá)。與未經(jīng)成骨誘導(dǎo)的H-PDLSCs 相比，*P＜0.05；與成骨誘導(dǎo)的H-PDLSCs 相比，# P＜0.05。

2.3 Wnt / Ca2+信號(hào)通路的激活可以提高P-PDLSCs 的成骨分化能力 Wnt / Ca2+信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)WB 結(jié)果顯示：在常規(guī)培養(yǎng)的條件下H-PDLSCs 與P-PDLSCs 細(xì)胞中CaMKII以及NLK 的表達(dá)水平無明顯變化，但是成骨誘導(dǎo)7d 后二者的表達(dá)量均顯著增高(圖3)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，P-PDLSCs 細(xì)胞CaMKII、NLK 成骨誘導(dǎo)后的表達(dá)水平低于H-PDLSCs。Runx2、ALP 是成骨的關(guān)鍵蛋白，經(jīng)過7d 的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行定向誘導(dǎo)之后可見H-PDLSCs 與P-PDLSCs 兩種蛋白的表達(dá)水平均顯著增高，但P-PDLSCs 中二者的水平低于H-PDLSCs(圖3)。

3. 討論

牙周病治療的理想結(jié)果是獲得牙周支持組織包括牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的完全再生。組織工程技術(shù)為牙周治療開辟了新的途徑，牙周膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用。牙槽骨保持著穩(wěn)定的生理性動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡受到干擾后則表現(xiàn)出病理性過程，維持上述平衡的是間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)干細(xì)胞的各項(xiàng)功能受到嚴(yán)密的分子調(diào)控。前期我們的研究結(jié)果表明，慢性牙周炎組織來源的牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力降低，這即是牙周組織再生能力下降的關(guān)鍵因素之一[7，8]。

干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，受到多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的調(diào)控，比較經(jīng)典的如BMP、Wnt、Notch、FGF、PI3K/ Akt 等，這些信號(hào)通路最終匯聚到成骨細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2，影響Runx2 的轉(zhuǎn)錄和成骨細(xì)胞的分化。其中Wnt 信號(hào)通路是公認(rèn)的在干細(xì)胞骨向分化過程中對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起指導(dǎo)作用的一種重要的信號(hào)系統(tǒng)，在牙周膜干細(xì)胞成骨分化的過程中研究較多的為Wnt 經(jīng)典信號(hào)通路[9]。但是，Wnt 經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路在干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，對(duì)不同時(shí)期、不同部位軟骨形成不僅有正調(diào)控作用，還有負(fù)調(diào)控作用。非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號(hào)通路通過鈣依賴性激酶、鈣調(diào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子N-F-AT 起作用。越來越多的研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+震蕩和維持未分化人干細(xì)胞的穩(wěn)定之間存在密切的聯(lián)系。激活Wnt／Ca2+信號(hào)通路可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，從而激活CaMKⅡ，以及pkc(protein kinase C，PKC)，雖然眾多研究報(bào)道G 蛋白參與在Wnt／Ca2+信號(hào)通路，但是目前尚無G proteins 與Frizzleds 蛋白直接結(jié)合的證據(jù)，CAMKII 則為非經(jīng)典信號(hào)通路中游的關(guān)鍵蛋白[10]。目前還有研究表明在非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號(hào)通路中TAK-TAB作為支架蛋白在該信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，二者結(jié)合后可與NLK 結(jié)合啟動(dòng)下游分子信號(hào)，可使NLK 進(jìn)入胞核，可以與一些特定的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光檢測(cè)手段檢測(cè)到正常及炎癥組織來源PDLSCs 細(xì)胞漿內(nèi)均表達(dá)非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的中游關(guān)鍵蛋白CaMK Ⅱ，而在H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)后CaMKⅡ表達(dá)的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)變化，這提示非經(jīng)典的Wnt／Ca2+信號(hào)通路參與了正常及炎癥組織來源牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。

為了進(jìn)一步準(zhǔn)確的探尋Wnt / Ca2+信號(hào)通路在成骨誘導(dǎo)作用下是否參與了P-PDLSCs 成骨分化及調(diào)控，我們對(duì)CaMKII 與NLK 做出了相應(yīng)檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在成骨誘導(dǎo)后H-PDLSCs 與P-PDLSCs細(xì)胞中CaMKII、NLK 的表達(dá)水平顯著增高，這說明成骨誘導(dǎo)的微環(huán)境可以激活非經(jīng)典Wnt / Ca2+信號(hào)通路。但是我們發(fā)現(xiàn)，炎癥微環(huán)境作用下CaMKII、NLK 的表達(dá)水平低于正常組織來源的干細(xì)胞。此外，我們從基因及蛋白水平分別檢測(cè)了H-PDLSCs 與P-PDLSCs 成骨分化過程中的關(guān)鍵分子。結(jié)果表明，無論是成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2 還是成骨關(guān)鍵蛋白ALP 的表達(dá)水平在H-PDLSCs與P-PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7d 后均有所升高，但是P-PDLSCs 中兩種關(guān)鍵分子的水平低于H-PDLSCs。鈣離子的沉積量是骨形成的關(guān)鍵，CaMKII 在細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)鈣離子的狀態(tài)影響骨的形成。在非經(jīng)典Wnt / Ca2+信號(hào)通路中CaMKII處于該信號(hào)的中游水平，可以間接的作用于其下游的NLK，NLK 蛋白與支架蛋白結(jié)合后可以進(jìn)入細(xì)胞核與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而改變干細(xì)胞的功能[11，12]。

在激活Wnt/ Ca2+信號(hào)通路后NLK 與其支架蛋白TAK-TAB 結(jié)合后可進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)NLK 可以抑制TCF/ LEF 復(fù)合體結(jié)合DNA，以此抑制細(xì)胞增殖。我們的研究結(jié)果表明，無論正常組織來源的還是炎癥組織來源的PDLSCs 成骨誘導(dǎo)7d 后都可以發(fā)現(xiàn)CaMKII 和NLK 水平的升高。結(jié)合目前的研究前沿我們認(rèn)為干細(xì)胞分化過程中Wnt 經(jīng)典與非經(jīng)典信號(hào)通路共同發(fā)揮作用，二者之間的變化趨勢(shì)也證實(shí)了二者存在相互作用，在調(diào)控干細(xì)胞介導(dǎo)的骨再生過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。但Wnt 非經(jīng)典信號(hào)通路在細(xì)胞漿內(nèi)活化鈣離子及在胞核內(nèi)啟動(dòng)相應(yīng)的下游靶基因的復(fù)雜作用機(jī)制仍需深入探討。

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