張 井，張 磊，李 雙，柳金良，曹 強，秦 超，殷長軍

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210000)

·基礎(chǔ)研究·

mTOR啟動子區(qū)基因多態(tài)性與腎癌發(fā)病風險的關(guān)系

張 井，張 磊，李 雙，柳金良，曹 強，秦 超，殷長軍

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210000)

目的 mTOR 信號通路在腎癌的形成過程中起著重要作用。本研究旨在探索mTOR信號通路相關(guān)基因多態(tài)性與腎癌易感性的關(guān)系。方法 采用病例-對照研究，對710例腎癌患者和760例健康人群，應用TaqMan探針分型法對AKT1、AKT2、PTEN和mTOR基因功能區(qū)8個基因多態(tài)性進行分型?？刂苹祀s因素，應用非條件邏輯回歸，評價基因多態(tài)性與腎癌的關(guān)系。結(jié)果 在8個基因多態(tài)性位點中，我們通過校正后的多因素分析發(fā)現(xiàn)位于mTOR啟動子區(qū)的(rs2295080)與腎癌的風險成負相關(guān)(P=0.005,OR=0.74, 95%CI=0.59～0.91, TG/GGvs. TT)。另一位于PTEN基因3’端非翻譯區(qū)的位點，其多態(tài)性與腎癌的風險成正相關(guān)(P=0.014,OR=1.45,95%CI=1.08～1.96, CCvs. TT)，然而通過校正后的多因素分析，我們發(fā)現(xiàn)上述關(guān)系在統(tǒng)計學上并無明顯統(tǒng)計學意義。此外，rs2295080 G等位基因腎臟組織中，mTOR表達水平明顯降低。沒有發(fā)現(xiàn)其他幾個多態(tài)性位點與腎癌風險存在明顯的相關(guān)性。結(jié)論 位于mTOR啟動子區(qū)的rs2295080多態(tài)性與腎癌的易感性有關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性；腎細胞癌；rs2295080； 風險

腎癌是最常見的腎臟腫瘤，占所有腎臟惡性腫瘤的80%以上[1-2]。盡管腎癌的確切病因仍然未知，異常的血管形成被認為是一個重要因素[3-4]。mTOR信號通路在細胞的生長、生存、增殖和血管生成過程起著重要的作用[5]。mTOR信號通路相關(guān)基因改變，如PI3K、 AKT、PTEN的突變，促進了腫瘤的形成，這在人類腫瘤中相當常見[6-8]。

目前，已有研究報道本研究所涉及的單核苷酸多態(tài)性可以影響個體腎癌的易感性[9]?；趍TOR信號通路在腎癌中的重要作用，本實驗研究了此信號通路中5個核心基因(PI3KCA、AKT1、AKT2、 PTEN、MTOR)，分析所選的8個位點的單核苷酸多態(tài)性，以及它們在中國人群腎癌形成過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究總共招募了從2004年5月至2011年9月期間在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診或體檢的710例腎癌病例與760名健康個體。病例和對照的入組條件參照先前的研究[10]。所有新診斷為腎癌的病例均得到了組織病理學的確認。兩組排除標準：既往患腫瘤病史、放化療病史。無年齡與性別限制，符合條件者即招募入組。依據(jù)WHO標準分類，并參照2002年美國聯(lián)合委員會制定的癌癥TNM標準對腎癌分期。對照組主要來自至我院門診健康體檢的人群，并依據(jù)同性別年齡±5歲與病例組匹配。對照人群來自我院門診體檢正常人群，與病例組人群之間無血緣關(guān)系，并且沒有癌癥病史。在招募入組前，由經(jīng)過專業(yè)培訓的調(diào)查人員進行面對面的標準問卷調(diào)查來收集人口特征和相關(guān)因素資料。征得書面知情同意后，抽取每位研究對象5 mL外周血。病例和對照組的響應率>85%。

1.2 單核苷酸多態(tài)性 mTOR信號通路的5關(guān)鍵基因：PI3KCA、AKT1、AKT2、PTEN和mTOR。通過檢索HapMap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)和dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，篩選出這些基因的單核苷酸多態(tài)性位點(表1)。多態(tài)性位點的選取標準：①定位于5′末端序列，5′非翻譯區(qū)，3′非翻譯區(qū)，或者有氨基酸變化的編碼區(qū);②中國人群中最小等位基因頻率>5%；③有研究表明與癌癥相關(guān)。根據(jù)該標準，我們篩選出8個單核苷酸多態(tài)性位點：包括AKT1的rs2494750和rs2498786，AKT2的rs33933140和rs7254617，PTEN的rs11202607和rs701848，以及mTOR的rs2295080和rs2536。

表1 單核苷酸多態(tài)性分析的引物與探針序列

單核苷酸多態(tài)性引物與探針序列(5′～3′)rs2494750FCGGAGGAACTTCTGGCTAGGARTGGGACACAGACCCCTTTCTCGFAM?CCTGCACTCTCCTGT?MGBCHEX?CCTGCACTGTCCTGT?MGBrs2498786FGGATTCGTCCCTGACCTGTCTRTCAGTTTCCCCGTCTGTAAAGTGGFAM?CTCGCTCTGCCGTGACCCTAGC?MGBCHEX?CTCGCTCTGCGGTGACCCTAGC?MGBrs7254617FGCAGACGTCGGAGTCCTAGTGRTGCGCACATTAGACAACTTTGGGFAM?TGCGTAGCCCCATC?MGBAHEX?TGCGTAGCTCCATC?MGBrs33933140FCAGGCGCCATGCTTCACRCCAGACTCGCATTTGGAAGACGHEX?ATTAAAACCTGAGTCTCCAA?MGBAFAM?ATTAAAACCTGAATCTCCAA?MGBrs701848FCATAGTGCTCCCCCGAGTTGRCCGCTTAAAATCGTATGCAGTCTTFAM?ACTAGGGCTTCAATTT?MGBCHEX?ACTAGGGCCTCAATT?MGBrs11202607FTCTTTGTTACAATTTCGGGCACRAATAATAACAGTGCAAAAGCCCATTHEX?CGCATATTAAAATGTAACTT?MGBCFAM?CGCATATTAAAACGTAACT?MGBrs2295080FCTTCCCCGCTGTCCTCTAAGRCCATCTTCTCCCTATACCTGTCGGHEX?CTCAGGGCTGGGAA?MGBTFAM?TCAGGGATGGGAAC?MGBrs2536FCATGGTGTCTAGACATGGCTACACTRGAGGTGCTGAACACAGGGAAGTFAM?CTCATAATTTCCAATATGT?MGBCHEX?CTCATAATTCCCAATATG?MGB

1.3 DNA提取與基因型分型 通過蛋白酶K消化和氯仿萃取，從外周血中提取基因組DNA。在南京醫(yī)科大學的分子與毒理學實驗室，用預先設(shè)計的探針單核苷酸基因分型試劑(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)對8個單核苷酸多態(tài)性位點進行分析。引物和探針的序列見表1，采取10 μL的反應體系，包括20 ng基因組DNA,3.5 μL 2×TaqMan Genotyping Master Mix,0.25 μL引物和探針混合物，以及6.25 μL的去離子水。擴增過程及條件如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個循環(huán)。依據(jù)說明書，擴增與分析過程在384孔板ABI7900HT 實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進行。使用SDS2.4(Applied Biosystems)分析樣本的等位基因型。這些單核苷酸的基因分型率均在98%以上。為了使實驗更加精確，每塊板包含了4個陰性對照，隨機選取5%的樣本進行重復基因分型，并且每次結(jié)果都是一致的。

1.4 mTOR mRNA的表達分析 選取18對手術(shù)切除的腎癌組織及相應的癌旁組織，另加24個癌旁正常腎組織，分析體內(nèi)mTOR mRNA 的表達水平。從手術(shù)切除的組織上切取標本，并立即存于液氮。選取100 mg組織，用Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)試劑提取總RNA,然后應用oligo(dT) 引物和Superscript II(Invitrogen)將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。在ABI Prism7900 sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA)，通過實時定量RT-PCR的方法，以ACTB基因作為內(nèi)參，檢測mTOR mRNA的表達水平。mTOR：前引物：5′-TTGCTTGAGGTGCTACTG-3′；后引物：5′-CTGACTTGACTTGGATTCTG-3′。ACTB：前引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；后引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應混合物包含各種引物0.1 M，26 μL SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa, Berkeley, CA, USA)以及1 μLcDNA(1∶10稀釋)。反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個反應重復3次。

1.5 統(tǒng)計學分析 運用t檢驗(連續(xù)變量)或者χ2檢驗(分類變量)統(tǒng)計病例組與對照組之間的人口分布特征及基因型頻率的差異。在進行Hardy-Weinberg平衡定律分析之前，我們運用擬合優(yōu)度卡方檢驗，檢測研究對象的單核苷酸多態(tài)性等位基因的頻率。校正可能的混雜因素后，我們運用非條件邏輯回歸分析，計算比值比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)，評估多態(tài)性與腎癌風險性之間的關(guān)系?；贐enjamini-Hochberg方法，我們應用假陽性率校正P值，進行多重比較。當基于假陽性率校正后的P值<0.05為兩者之間的關(guān)系在統(tǒng)計學上是有意義的。所有的分析均使用SAS 9.1.3軟件，所有的統(tǒng)計均為雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群的變量分布 710例病例與760例健康對照的人口學指標及吸煙、飲酒等危險因素的差異見表2。兩組之間的年齡、性別、BMI和飲酒之間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。但病例組中吸煙、高血壓和糖尿病患者所占比例顯著高于對照組(P值分別為0.035,<0.01和<0.01)。在710例患者中，腎癌分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的患者分別占62.8%、19.6%、7.3%、10.3%；腫瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分級的比例分別是19.2%、48.0%、24.5%和8.3%。

2.2 腎癌中mTOR的表達、mTOR rs2295080 和mTOR表達的相互聯(lián)系 采用實時定量PCR，我們檢測腎癌及癌旁組織中mTOR表達水平，并探索癌旁腎組織中rs2295080多態(tài)性與mTOR表達水平之間的關(guān)系。如圖1A所示：與鄰近的正常腎組織相比，腎癌組織中mTOR的表達水平顯著升高。

圖1 腎透明細胞癌組織及鄰近癌旁正常組織中mTOR的表達情況

A:與癌組織相比，鄰近癌旁組織中mTOR表達量升高(P=0.018)；B:與mTOR rs2295080 TG和GG基因型相比，mTOR rs 2295080 TT基因型中mTOR 表達量更高，P值分別為0.003和0.011。

表2 病例組與對照組的各項人口學特征分布情況 [例(%)]

此外，在癌旁組織中，與攜帶G等位基因(TG和GG基因型)的個體相比攜帶TT基因型的個體組織中mTOR的表達水平顯著升高(TGvs.TT and GGvs. TT,各自的P值分別為0.003和0.011)(圖1B)。這些結(jié)果表明：mTOR表達水平的升高有可能參與了腎癌的發(fā)生，其原因可能與mTOR啟動子區(qū)rs2295080位點的多態(tài)性通過調(diào)節(jié)mTOR的轉(zhuǎn)錄，參與了腎癌的形成。

2.3 AKT1/AKT2/PTEN/MTOR多態(tài)性和等位基因頻率以及與腎細胞癌風險性之間的關(guān)系 遺傳模型顯示了這些多態(tài)性與腎細胞癌風險性之間的相互關(guān)系(表3)和多態(tài)性的基因型的詳細分布信息(表4)。八個多態(tài)性位點均符合Hardy-Weinberg平衡。與腎細胞癌的風險相關(guān)性最顯著的多態(tài)性位點為rs2295080，它位于mTOR的啟動子區(qū)域。與攜帶rs2295080 TT的基因型的個體相比，攜帶TG基因型或TG/GG基因型的個體腎癌發(fā)病風險明顯降低(TG:P=0.021,OR=0.81, 95%CI=0.68～0.97；TG/GG:P=0.005,OR=0.74,95%CI=0.59～0.91)。經(jīng)過多重檢驗校正后，rs2295080和腎癌風險之間的相關(guān)性仍然有顯著統(tǒng)計學意義[假陽性率(false discovery rate,FDR)=0.040]。除了這個位點外，位于PTEN基因 3′非翻譯區(qū)的rs701848位點的純合子(CC)與腎癌發(fā)病顯著相關(guān)(P=0.014,OR=1.45, 95%CI=1.08～1.96)。在多重比較后，這種相關(guān)性仍然具有顯著統(tǒng)計學意義(FDR=0.056)。基于PTEN的負性調(diào)節(jié)作用，我們研究了mTOR rs2295080和 PTEN rs701848兩者的相互作用及其對腎癌風險的影響。結(jié)果顯示，盡管同時攜帶兩個危險基因型(rs2295080 TT and rs701848 CC)的個體腎癌的風險性增加了1.72倍(表5)，兩者之間并無明顯的相互作用(P相互=0.118)。在篩選出的幾個位點中，由于mTOR rs2295080位點顯現(xiàn)出最佳的相互關(guān)系，因此我們將它作為主要研究對象。

4 討 論

我們研究了中國人群中mTOR信號通路相關(guān)基因的8個多態(tài)性位點與腎癌易感性之間的關(guān)系。位于mTOR啟動子區(qū)的rs2295080的多態(tài)性降低了腎癌的易感性。我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs2295080 G等位基因的個體mTOR mRNA水平呈低表達。此外，這些實驗證實rs2295080 G 等位基因顯著減低了mTOR的轉(zhuǎn)錄水平。因此，mTOR rs2295080位點多態(tài)性是功能性的單核苷酸多態(tài)性。

表3 AKT1、AKT2、PTEN和MTOR基因型單核苷酸多態(tài)性的信息及腎癌風險性的關(guān)系 [例(%)]

*調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓后的回歸模型;SNP:單核苷酸多態(tài)性；MAF:最小等位基因頻率；3′UTR:3′非翻譯區(qū)。

表4 病例組與對照組中各基因型和等位基因的分布差異及與腎癌風險性的關(guān)系 [例(%)]

續(xù)表4

指標病例組對照組P值?校正R(95%CI)?PTENrs11202607 CC567(79．7)599(78．8) 1．0(內(nèi)參) CT138(19．4)156(20．5)0．5160．92(0．71～1．19) TT5(0．7)5(0．7)0．9861．00(0．28～3．60) CT+TT143(20．1)161(21．2)0．5270．92(0．71～1．19) P趨勢0．654PTENrs701848 TT222(31．3)277(36．5)1．0(內(nèi)參) TC338(47．6)351(46．2)0．1681．18(0．93～1．49) CC150(21．1)132(17．3)0．0141．45(1．08～1．96) TC+CC488(68．7)483(63．5)0．0451．25(1．01～1．56) P趨勢0．017mTORrs2295080 TT454(63．9)438(57．6)1．00(內(nèi)參) TG218(30．7)277(36．5)0．0210．81(0．68～0．97) GG38(5．4)45(5．9)0．5260．86(0．55～1．37) TG+GG256(36．1)322(42．4)0．0050．74(0．59～0．91) P趨勢0．028mTORrs2536 TT607(85．5)628(82．6)1．0(內(nèi)參) TC99(13．9)128(16．9)0．0740．77(0．58～1．03) CC4(0．6)4(0．5)0．8110．84(0．19～3．61) TC+CC103(14．5)132(17．4)0．0720．77(0．58～1．02) P趨勢0．161

*調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓后的回歸模型。

表5 mTOR rs22095080與PTEN rs701848及腎癌發(fā)病風險性的關(guān)系 [例(%)]

*代表等位基因的頻率；#調(diào)整年齡、性別、體重指數(shù)、飲酒、糖尿病、和高血壓后的邏輯回歸模型。

本研究驗證了mTOR通路與腎癌的關(guān)系，盡管mTOR的過度活化是源于蛋白表達的增加還是源于mTOR蛋白的過度磷酸化仍然未知[11-12]，但是過度活化的mTOR一直被認為是腎癌的標志。結(jié)合一些與腎癌細胞株[11]和腎癌切除標本[13]有關(guān)的研究，我們推測mTOR的高表達可促進腎癌的形成。在本研究中，我們也觀察到腎癌組織與癌旁組織相比，mTOR mRNA表達水平顯著增高，這進一步表明mTOR的過度表達促進了腎癌的形成。在一些腫瘤中，mTOR高表達被認為與不良的預后相關(guān)，如肺癌[14]、乳腺癌[15]、喉鱗癌[16]以及膽道腺癌[17]。mTOR啟動子區(qū)rs2295080 G等位基因多態(tài)性引起mTOR的表達減少，可能降低了腎癌的易感性。

此外，經(jīng)多重比較校正后，我們發(fā)現(xiàn)PTEN基因rs701848多態(tài)性一定程度上增加了腎癌的風險性。這一多態(tài)性位于PTEN基因的3′非翻譯區(qū)，它可以通過影響mRNA的穩(wěn)定性，進而改變PTEN的表達水平。然而，這一推測有待進一步證實。由于PTEN負性調(diào)控mTOR信號通路，mTOR rs2295080和PTEN rs701848多態(tài)性也可能存在相互關(guān)系。盡管同時攜帶兩個單核苷酸多態(tài)性風險基因型(rs2295080 TT和rs701848 CC的個體罹患腎癌的風險性增加了1.57倍，我們并未發(fā)現(xiàn)這兩個單核苷酸多態(tài)性之間存在顯著的相關(guān)性。

目前，分子靶向藥物，如酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼、血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑帕唑帕尼以及mTOR抑制劑西羅莫司和依維莫司，已被批準用于治療晚期腎癌。最近有研究證實血管生成相關(guān)基因的多態(tài)性可以預測腎癌患者對帕唑帕尼單藥治療的療效[18]。此外，也有文章報道，參與影響舒尼替尼藥代動力學的基因多態(tài)性與使用舒尼替尼治療轉(zhuǎn)移性腎癌患者的無進展生存期相關(guān)[19]。此外，mTOR rs2295080多態(tài)性與接受放化療治療的食管癌患者的臨床預后有關(guān)[20]?；趓s2295080在調(diào)節(jié)mTOR表達方面的作用，這一多態(tài)性可能作為遺傳標志，用于預測患者對西羅莫司或依維莫司的治療反應性。

本研究結(jié)果表明，mTOR rs2295080多態(tài)性影響中國人群腎癌易感性。mTOR rs2295080變異可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性mTOR表達水平，進而影響腎細胞癌的易感性。但是rs2295080多態(tài)性改變mTOR表達水平，是否能影響mTOR的磷酸化，從而影響下游信號通路和這種多態(tài)性是否影響腎癌患者的預后，以及腎癌患者對西羅莫司和依維莫司治療的反應，有待進一步研究。

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(編輯 何宏靈)

Polymorphism in the mTOR promoter is associated with risk of renal cell carcinoma

ZHANG Jing, ZHANG Lei, LI Shuang, LIU Jin-liang,CAO Qiang, QIN Chao, YIN Chang-jun

(Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210000, China)

Objective To explore the association between the polymorphism of mTOR pathway-related genes and risk of renal cell carcinoma (RCC). Methods Eight potentially functional polymorphisms in AKT1, AKT2, PTEN and mTOR genes were genotyped using the TaqMan method in a case-control study of 710 RCC patients and 760 cancer-free subjects. Unconditional logistic regression, adjusted for potential confounding factors, was used to assess the risk associations. Results Of the 8 polymorphisms, after being adjusted for multiple comparisons, a significant association was found between one variant (rs2295080) in the promoter of mTOR and reduced RCC risk (P=0.005,OR=0.74, 95%CI=0.59-0.91, TG/GGvs. TT). Another variant (rs701848) in the 3’UTR region of PTEN was associated with increased RCC risk (P=0.014,OR=1.45, 95%CI=1.08-1.96, CCvs. TT); however, the association was not significant after being adjusted for multiple comparisons. Furthermore, lower mTOR mRNA levels were observed in the presence of the rs2295080G allele in normal renal tissues. No other significant association between the selected polymorphisms and RCC risk was observed. Conclusion Our results suggest that the mTOR promoter rs2295080 variant affects RCC susceptibility, which needs further validation.

single nucleotide polymorphisms; renal cell carcinoma; rs2295080; risk

2014-10-08

2015-01-25

國家自然科學基金(81201571)

殷長軍，教授.E-mail：drcjyin@163.com

張井(1989-)，男(漢族)，碩士研究生.研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail:zhangjing2711@126.com

R699

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.05.014