代如意，殷中瓊，賈仁勇，2，李 莉，李 曼，，康 帥，彭練慈，曲 徑

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川溫江611130)

中藥組方“虎訶紫”的急性毒性試驗(yàn)及對雞白痢的臨床療效

代如意1，殷中瓊1，賈仁勇1，2，李 莉1，李 曼1，，康 帥1，彭練慈1，曲 徑1

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川溫江611130)

【目的】探討中藥組方“虎訶紫”的毒性及對雞白痢沙門菌Salmonella pullorum的療效.【方法】根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則，對中藥組方提取物進(jìn)行小鼠灌胃急性毒性試驗(yàn)，同時(shí)以人工誘發(fā)雞白痢沙門菌的雛雞感染模型，按高、中、低(4.20、1.62、0.48 g/d)劑量飲水給藥，連續(xù)7 d，評價(jià)中藥組方“虎訶紫”顆粒劑的療效.【結(jié)果和結(jié)論】急性毒性試驗(yàn)給藥劑量大于5 000 mg/kg，小鼠無死亡，即LD50＞5 000 mg/kg，對其進(jìn)行中藥組方提取物最大耐受量的測定，其最大耐受量為40 g/kg;高劑量顆粒劑組治愈率和有效率分別是75.0%和83.3%，中劑量顆粒劑組的治愈率和有效率分別是72.7%和81.8%，低劑量顆粒劑組的治愈率和有效率分別為62.5%和75.0%，而感染對照組的死亡率為40%;χ2檢驗(yàn)表明“虎訶紫”顆粒劑高、中劑量組與感染對照組的死亡率差異顯著(P＜0.05).結(jié)果表明:中藥組方無毒;高劑量組的治愈率、有效率都高于中、低劑量組，高、中劑量組的死亡率都低于感染對照組，說明高、中劑量組對雞白痢沙門菌的死亡具有一定的保護(hù)作用.

中藥組方“虎訶紫”;急性毒性試驗(yàn);雞白痢沙門菌;療效

雞白痢沙門菌Salmonella pullorum對各種品種的雞均有易感性，以2～3周齡內(nèi)雛雞的發(fā)病率與病死率為最高，呈流行性.成年雞感染呈慢性或隱性經(jīng)過，近年來，育成階段的雞發(fā)病也日趨普遍.火雞對本病有易感性，一直存在本病的雞場，雛雞的發(fā)病率為20%～40%，新傳入本病的雞場，其發(fā)病率顯著增高，有時(shí)可高達(dá)100%，病死率也比老疫場高，發(fā)病雛雞呈最急性者，無臨診癥狀迅速死亡，稍微者或帶菌者表現(xiàn)精神委頓，絨毛松亂，兩翼下垂［1］.臨床治療雞白痢沙門菌病主要是復(fù)方頭孢唑啉鈉非批準(zhǔn)使用的藥物、氟苯尼考和硫酸安普霉素等化學(xué)藥物［2-3］，化學(xué)藥物治療效果迅速，但是藥物殘留在動(dòng)物體內(nèi)對人類的健康產(chǎn)生了一定危害，由于我國濫用抗生素的現(xiàn)象比較突出，使得我國在外貿(mào)活動(dòng)中多次遭到其他國家的禁售，面對這樣的處境，國家對獸醫(yī)的管理制度進(jìn)行改革，減少化學(xué)藥物在臨床上的應(yīng)用，增加中藥在治療動(dòng)物疾病的比例，中獸藥的開發(fā)迫在眉睫.本試驗(yàn)在前期通過體外抑菌試驗(yàn)對幾十味中藥的篩選，選出虎杖Polygonum cuspidatum、訶子Terminalia chebula和紫花地丁Violet yedoensis 3味中藥組成組方，制成“虎訶紫”飲水顆粒劑的基礎(chǔ)上，對該中藥組方進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，并對人工誘發(fā)感染雞白痢沙門菌的雛雞進(jìn)行療效觀察，以確定中藥組方的藥效作用，為中獸藥的研發(fā)提供新的處方.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與藥品

昆明系小鼠80只(許可證號(hào):SYXK2011-027)，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，購于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院.試驗(yàn)1日齡小雞購于四川省雅安市名山區(qū)家禽養(yǎng)殖合作社孵化場，隔離飼養(yǎng)雞白痢沙門菌陰性.

1.2 試驗(yàn)藥品

虎杖(產(chǎn)地四川，批次081102)、訶子(產(chǎn)地云南，批次 090401)、紫花地丁(產(chǎn)地四川，批次110502)均購于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司.中藥組方“虎訶紫”顆粒劑(批號(hào):130481)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系自制.西藥慶大霉素為宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品.

1.3 菌種與培養(yǎng)基

雞白痢沙門菌(CVCC1792)菌種購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，MH肉湯培養(yǎng)基(Meller-Hinton broth)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient agar)、麥康凱培養(yǎng)基(MacConkey agar)、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Baird-Parker agarbase)、SS瓊脂培養(yǎng)基(Salmomella Shigella agar)均為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品.

1.4 菌液制備

將凍干雞白痢沙門菌的菌種接種于麥康凱培養(yǎng)基，在37℃條件培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落在普通營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，按照10倍稀釋法對肉湯中的細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出雞白痢沙門菌原液個(gè)數(shù)為8× 108cfu/mL，以作為攻毒菌液.

1.5 藥液的制備

將3味中藥按照文獻(xiàn)［4-6］的最佳工藝進(jìn)行提取，保證浸膏得率，并將虎杖、訶子和紫花地丁3味中藥的浸膏按照質(zhì)量比3∶2∶1的比例用體積分?jǐn)?shù)為5%二甲亞砜對其進(jìn)行溶解，將制備好的藥液放入4℃冰箱保存，作為急性毒性試驗(yàn)的備用藥液.

1.6 急性毒性試驗(yàn)

1.6.1 預(yù)試驗(yàn) 將50只小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，給藥前禁食6 h，各組分別將配好的藥液按照10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 g/kg(按原生藥材計(jì))灌胃給藥，給藥劑量以每只不超過0.4 mL為標(biāo)準(zhǔn)，以確定試驗(yàn)小鼠0和100% 死亡的劑量范圍.給藥2 h后自由飲食，連續(xù)觀察7 d，每天上、下午各觀察1次，當(dāng)給藥劑量按體質(zhì)量計(jì)大于5 000 mg/kg時(shí)小鼠沒有出現(xiàn)死亡，表明LD50大于5 000 mg/kg［7］，進(jìn)一步對中藥組方進(jìn)行最大耐受量的測定.

1.6.2 最大耐受量(MTD)測定 將30只小鼠平均分成3組，每組10只，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食6 h，按照等間距設(shè)置3個(gè)劑量組，每組給小鼠灌胃藥劑量分別為42.8、45.8、49.0 g/kg，給藥后記錄小鼠的精神、飲食、飲水情況，連續(xù)觀察14 d，對死亡的小鼠和觀察期滿的小鼠進(jìn)行解剖，觀察組織變化，無小鼠死亡的劑量組為中藥組方的最大耐受量.

1.7 “虎訶紫”顆粒劑的臨床療效觀察

1.7.1 攻毒劑量測定 攻菌量以近半數(shù)致死量為宜.取試驗(yàn)雞50只，隨機(jī)分為5組，每組10只雛雞，注射的雞白痢沙門菌菌數(shù)增加，雛雞表現(xiàn)出雞白痢明顯癥狀，見表1.對死亡雞進(jìn)行剖檢，肝臟、脾臟等進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定，依死亡率大小最終確定以腹腔注射方式進(jìn)行攻毒，攻毒劑量定為2.0×109cfu/mL.

表1 動(dòng)物感染劑量模型Tab.1 M odels of animal infectious dose

1.7.2 人工感染治療試驗(yàn) 將90只1日齡的健康雛雞，飼養(yǎng)至5日齡進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組15只，除健康對照組外其他各組腹腔注射0.5 mL雞白痢沙門菌.第1～3組分別為“虎訶紫”顆粒劑的治療組，按用藥劑量分為高、中、低劑量組，單次給藥劑量每只分別為1.40、0.54、0.16 g，每天3次給藥;第4組為對照藥物(慶大霉素可溶性粉)治療組，單次給藥劑量為33.3 mg/L;第5組為感染對照組;第6組為健康對照組，不做任何處理.感染后6 h，飲水給藥，每天3次，連用7 d，隔離飼養(yǎng)，觀察和記錄雛雞的臨床癥狀、死亡率、治愈率等.

1.8 藥效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

發(fā)病率:凡在試驗(yàn)期間臨床觀察出現(xiàn)瀉白色糞便典型的雞白痢癥狀，判為發(fā)病.

治愈率:凡在試驗(yàn)期間，經(jīng)飲水給藥后精神狀況及食欲恢復(fù)正常，不出現(xiàn)白色稀便，糞便經(jīng)分離培養(yǎng)未有沙門菌檢出，判斷治愈，根據(jù)治愈雞占整組試驗(yàn)雞的比例計(jì)算治愈率.有效:在試驗(yàn)期間，雞經(jīng)混飲給藥后，腹瀉等癥狀減輕，精神狀態(tài)、食欲、呼吸等逐步恢復(fù)正常者均屬有效.有效率=癥狀好轉(zhuǎn)雞數(shù)/發(fā)病雞數(shù).死亡率:患病雞食欲、糞便仍無明顯改善，出現(xiàn)典型癥狀并死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)臟器有典型的病理變化，計(jì)為死亡雞.死亡率=死亡雞數(shù)/試驗(yàn)雞數(shù)［8-9］.

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥組方提取物的急性毒性試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)中藥組方提取物劑量為10～40 g/kg，小鼠灌胃后出現(xiàn)暫時(shí)不適應(yīng)，未見中毒癥狀或死亡，說明LD50大于5 000 mg/kg是實(shí)際無毒藥物，只需測定最大耐受量，按照等比間距測定出中藥組方提取物的最大耐受量.當(dāng)灌胃小鼠劑量達(dá)到50 g/kg，小鼠出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)遲緩，食欲不振，12 h后10只小鼠全部死亡，其他組表現(xiàn)中毒癥狀同上，但隨著中毒劑量逐漸減輕，24 h內(nèi)存活者基本正常，中藥組方提取物灌胃劑量大于40 g/kg有小鼠死亡，即中藥組方提取物的最大耐受量為40 g/kg(表2).

表2 中藥組方提取物對小鼠的最大耐受量Tab.2 Chinese herbal compound extractmaximum tolerated dose in m ice results

2.2 “虎訶紫”顆粒劑對雞白痢沙門菌治療效果

對治療人工感染的雞白痢沙門菌病使用的“虎訶紫”顆粒劑的劑量不同，其治療效果也有所差異，詳見表3.“虎訶紫”顆粒劑的高劑量組的治愈率、有效率和相對增質(zhì)量率分別大于中、低劑量組，其死亡率低于中、低劑量組;中劑量組治愈率、有效率和相對增質(zhì)量率分別大于低劑量組，其死亡率低于低劑量組.“虎訶紫”顆粒劑相對增質(zhì)量率都高于慶大霉素組，“虎訶紫”顆粒劑高、中劑量組對雞白痢沙門菌都有一定的治療效果.χ2檢驗(yàn)表明(表3)，“虎訶紫”顆粒劑高、中、低劑量組、慶大霉素組與感染對照組的死亡率差異顯著(P＜0.05)，“虎訶紫”顆粒劑高、中、低劑量組與慶大霉素組治愈率﹑有效率差異不顯著(P＞0.05).

表3 “虎訶紫”顆粒劑對雞白痢沙門菌的臨床試驗(yàn)結(jié)果1)Tab.3 Results of clinical trials of“Huhezi”granules on Salmonella pullorum

3 討論

中藥組方“虎訶紫”是通過大量篩選中藥得到治療雞白痢沙門菌的新藥組方，為確保新藥本身無毒能更好地治療雞白痢沙菌病，本試驗(yàn)通過急性試驗(yàn)來驗(yàn)證新藥組方的安全性，急性毒性是評價(jià)獸藥常用的方法，急性毒性試驗(yàn)是藥物毒理學(xué)安全性評價(jià)的第一步，具有了解獸藥急性毒性強(qiáng)弱的作用.本研究結(jié)果表明，中藥組方提取物劑量分別為10、20、30、40 g/kg時(shí)對小鼠進(jìn)行灌胃，小鼠全部存活，根據(jù)毒性等級評價(jià)［7，10］，當(dāng)LD50＞5 000 mg/kg時(shí)為實(shí)際無毒，而本組方提取物在40 g/kg時(shí)小鼠都未有死亡，其LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于5 000 mg/kg，說明該中藥組方為實(shí)際無毒組方，安全可靠.

中藥組方“虎訶紫”顆粒劑由虎杖、訶子和紫花地丁3種中藥共同組成，顆粒劑作用主要有清熱解毒，澀腸止瀉，斂肺止咳，降火利咽，肺虛喘咳，久嗽不止，涼血消腫等［11］，同時(shí)虎杖、訶子和紫花地丁都有抗菌作用［12-14］，而本研究結(jié)果也表明這3味中藥組成的組方對人工感染引起的雞白痢沙門菌具有良好的治療效果，治療效果隨著劑量的增加而更好.其中高、中劑量組的有效率與陽性對照慶大霉素組相差不大，而治愈率稍差于慶大霉素，總體而言治療效果與慶大霉素差異不顯著.但高、中劑量組的相對增質(zhì)量率均高于慶大霉素組和感染組，這可能與中藥含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，在治病的同時(shí)能調(diào)節(jié)生理機(jī)能有關(guān).

有報(bào)道以石榴皮、地榆、訶子等藥物為主藥組成“白痢康”制劑，發(fā)現(xiàn)其對雞白痢沙門桿菌人工感染雞進(jìn)行預(yù)防和治療，保護(hù)率達(dá)88%～90%，治愈率75.0% ～84.4%［15］，與本研究“虎訶紫”顆粒劑高劑量組83.3%的有效率和75.0%的治愈率相似.胡庭俊等［8］報(bào)道的馬尾藻多糖納米脂質(zhì)體對雞白痢沙門菌高劑量組的死亡率與本試驗(yàn)的死亡率也相符，表明“虎訶紫”對雞白痢沙門菌治療效果良好.

中藥資源豐富，價(jià)格相對較低，兼具營養(yǎng)和治病雙重作用，無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等，而“虎訶紫”顆粒劑安全無毒，對人工感染雞白痢沙門菌具有良好的治療效果和明顯的質(zhì)量增加作用，具有較好的臨床推廣意義.

［1］ 陳薄言.獸醫(yī)傳染病學(xué)［M］.5版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2006:119-120.

［2］ 李存彬.藥物對雞白痢沙門氏菌病的臨床療效試驗(yàn)［J］.中國畜禽種業(yè)，2010(6):149-150.

［3］ 李麗，王書全，王春華，等.雛雞白痢和大腸桿菌病的藥物治療試驗(yàn)［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2006，33(5):62-63.

［4］ 劉丹，湯海峰，張三奇，等.虎杖中有效成分提取方法的研究［J］.中成藥，2007，29(4):516-521.

［5］ 付戈妍，付克，王洪光，等.超聲波提取紫花地丁總黃酮及含量測定［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，23(5): 512-513.

［6］ 王雷，富麗靜，于翔，等.中草藥五倍子、訶子有效成分提取工藝的研究［J］.水生態(tài)學(xué)雜志，2009，2(1):135-137.

［7］ 農(nóng)業(yè)部獸藥評價(jià)中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編: 2006—2011［G］.北京:化工工業(yè)出版社，2012:84.

［8］ 胡庭俊，劉珊珊，韋現(xiàn)色，等.馬尾藻多糖納米脂質(zhì)體對人工感染雞白痢沙門氏菌預(yù)防試驗(yàn)［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011，13(6):10-12.

［9］ 高迎春，張傳津，都業(yè)良，等.地錦草顆粒對人工感染雞大腸桿菌病臨床療效試驗(yàn)［J］.中獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志，2012 (1):51-55.

［10］李建華.中藥類急性毒性計(jì)數(shù)法與LD50的分級［J］.中草藥，1994，25(7):388-389.

［11］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:二部［S］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:187-209.

［12］劉曉蓉.虎杖提取物抑菌作用的研究［J］.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，1(1):19-21.

［13］肖云峰，劉小雷，劉爽，等.訶子的藥理作用研究進(jìn)展［J］，北方藥學(xué)，2011，8(11):19-20.

［14］康懷興.紫花地丁的抗菌活性分析［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2012(14):51-52.

［15］盧斯亮，劉芳萍，王圣思.中藥在雞白痢沙門氏桿菌病中的應(yīng)用［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2010(1):54-55.

【責(zé)任編輯 柴 焰】

An acute toxicity test of compound traditional Chinesemedicine“Huhezi”and itsefficacy in chickens experimentally infected with Salmonella pullorum

DAIRuyi1，YIN Zhongqiong1，JIA Renyong1，2，LILi1，LIMan1，KANG Shuai1，PENG Lianci1，QU Jing1
(1 College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China; 2 Preventive Veterinary Research Institute，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China)

【Objective】To investigate the toxicity of compound traditional Chinesemedicine“Huhezi”and observe its efficacy in chickens experimentally infected with Salmonella pullorum.【Methods】According to the veterinary drug research technical guidelines，the acute toxicity testwas carried out inmice by gavage with“Huhezi”extracts.To evaluate the efficacy of“Huhezi”granules，the chickens experimentally infected with Salmonella pullorum were treated ata dosage of4.20，1.62，0.48 g/d respectively by drinking water for 7 successive days.【Result and conclusion】The dose of acute toxicity test of“Huhezi”extractswas over 5 000 mg/kg.No death was observed inmice，revealing LD50＞5 000mg/kg.Themaximum tolerated dose was40 g/kg.The cure rates of different dose granules groupswere 75.0%，72.7%，62.5%and the effective rateswere 83.3%，81.8%，75.0%respectively，while themortality rate of infected control group was 40%.The result ofχ2test showed that the mortality rate of high and medium dose group of“Huhezi”granule was significanty different from that of the infected control group.The results indicate that compound traditional Chinesemedicine extracts are non-toxic，and the high and medium dose of“Huhezi”granules have certain protection to infected death of S.pullorum，with cure ratesand effective rates of high dose group being higher than thatofmedium and low dose groups，themortality rates of high and medium dose groups being lower than that of the infected control groups.

compound traditional Chinesemedicine“Huhezi”;acute toxicity test;Salmonella pullorum; curative effect

S828

A

1001-411X(2015)01-0014-04

代如意，殷中瓊，賈仁勇，等.中藥組方“虎訶紫”的急性毒性試驗(yàn)及對雞白痢的臨床療效［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(1):14-17.

2014-05-10 優(yōu)先出版時(shí)間:2014-12-02

優(yōu)先出版網(wǎng)址:http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7671/j.issn.1001-411X.2015.01.003.html

代如意(1986—)，女，碩士研究生，E-mail:luoyunxiaoyi@163.com;通信作者:殷中瓊(1968—)，女，教授，博士，E-mail:yinzhongq@163.com

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD34B03-4);四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2013TD0015)