黃金萍，黃建邦，高 娃，曾麗霞，黃有明，宋銀平，岑伊靜

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州510642;2 包頭市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 包頭014060)

柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama 也稱亞洲柑橘木虱，屬半翅目Hemiptera 木虱科Psyllidae，為害柑橘Citrus reticulata Blanco、枸櫞Citrus medica L.、黃皮Clausena lansium(Lour)Skeels、九里香Murraya exotica(L.)Jacks 等蕓香科植物，是柑橘類新梢期的主要害蟲，若蟲排泄一種白色分泌物粘附于葉上，會引致煤煙病發(fā)生［1］.柑橘木虱喜通風(fēng)透光處，果園暴露、樹冠稀疏為害常較重.苗圃和幼年樹經(jīng)常抽發(fā)嫩芽新梢，也易發(fā)生木虱為害，嚴(yán)重時引起新梢生長不良，畸形扭曲，甚至慢慢干枯萎縮［2］.柑橘黃龍病病原菌屬于變形菌門Proteobacteria，α-變形菌綱α-proteobacterial，根瘤菌目Rhizobiales，根瘤菌科Rhizobiaceae，候選的韌皮部桿菌屬Candidatus Liberibacter［3］.根據(jù)病原16S rDNA 和β-操縱子基因的序列特征，以及傳病媒介和病原性質(zhì)，該屬分為亞洲種“Candidatus Liberibacter asiaticus”、美洲種“Ca.L.americanus”和非洲種“Ca.L.africanus”［4］3 種.前2種的媒介昆蟲主要為柑橘木虱［5］，非洲種由非洲柑橘木虱Trioza erytreae Del Guercio 傳播［6］.在我國發(fā)生的黃龍病為亞洲種.由于該病原菌屬于難純培養(yǎng)細(xì)菌［7］，其營養(yǎng)需求、胞壁成分和基因組成等方面的資訊甚為缺乏，造成分類研究上的困難.

盡管云南發(fā)現(xiàn)為害柑橘的柚喀木虱Cacopsylla citrisuga(Yang ＆ Li)也攜帶和傳播黃龍病菌［8-11］，柑橘木虱仍然為我國柑橘黃龍病主要的媒介昆蟲.柑橘木虱獲取黃龍病菌的時間很短，在病樹韌皮部取食1 h 就能檢測出病原的存在［12］.帶菌成蟲在柑橘苗上取食5 h 以上會傳?。?3］.獲菌飼育成蟲和從帶毒若蟲羽化的成蟲均能在短時間內(nèi)獲菌傳病，說明木虱成蟲在田間自然傳播黃龍病病原的效率相當(dāng)高［14］.柑橘木虱具有趨嫩性，無嫩梢時則在成熟葉片或老葉的葉背取食.本文比較了柑橘木虱取食感染黃龍病柑橘植株的嫩梢、成熟葉片和老葉后的獲菌效率，以期為黃龍病防治提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園的九里香Murraya exotica(L.)Jacks 上采集柑橘木虱成蟲，轉(zhuǎn)飼到網(wǎng)室內(nèi)栽培的健康九里香上繁殖多代.

從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃龍病研究室繁育的沙糖橘Citrus reticulata Blanco.cv.Shatangju 黃龍病盆栽苗上采集病芽，嫁接到健康酸橘上使其感染黃龍病.1年后將沙糖橘病芽摘除，表現(xiàn)典型黃龍病癥狀的酸橘通過Nested-PCR 檢測呈黃龍病亞洲種陽性.

血液/組織/細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒、蛋白酶K(廣州天根生物工程有限公司);rTaq、dNTPs、10×Buffer、DL2000 DNA Marker(Takara 公司);綠如藍(lán)核酸染料(廣州藍(lán)澤生物科技有限公司).PCR 引物由上海英捷生物技術(shù)公司合成;RTC-0200 DNA Engine Cycles(Bio-RAD 公司)、PAC 300 型恒壓恒流電泳儀(Bio-RAD 公司)、LabworksTM 凝膠成像系統(tǒng)(UVP 公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 柑橘木虱的飼菌方法 每個品種分別選用3株帶有嫩梢、成熟葉、老葉且發(fā)病程度和長勢一致的病苗進行飼菌試驗.其中最頂端葉片未完全展開的為嫩梢，嫩梢下一級枝梢上為成熟葉，成熟梢下一級枝條上為老葉.每個植株成熟葉和老葉均帶有典型的黃龍病斑駁黃化癥狀.1 株苗為1 個重復(fù).在每1株黃龍病植株的嫩梢、成熟葉、老葉3 個部位上，分別用1 個透明帶封口的塑料袋套袋后接10 頭健康的柑橘木虱成蟲，每株共接30 頭，讓柑橘木虱在各個部位上取食24 h 后取下，單頭提取DNA，通過PCR 分別檢測木虱的獲菌效率.塑料袋使用前用針扎適當(dāng)數(shù)量的小孔以利于透氣.

1.2.2 柑橘木虱DNA 的提取及Nested-PCR 檢測用天根試劑盒提取單頭柑橘木虱的DNA(方法參照天根試劑盒說明書).

獲得的單頭木虱DNA 采用Nested-PCR 法檢測黃龍病亞洲種病菌.使用未經(jīng)飼毒木虱的DNA 做為陰性對照組模板.第1 輪擴增采用的引物［15］為27F:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和1500R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3';第2 輪采用黃龍病亞洲種病菌特異引物［16］OI1:5'-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3' 和 OI2c:5'-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3'.擴增體系與反應(yīng)條件同Cen 等［11］.擴增后電泳檢測.

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘木虱取食馬水橘病苗的獲菌效率

柑橘木虱在馬水橘病苗的嫩梢、成熟葉和老葉3個部位取食24 h 后，單頭提取DNA 并進行PCR 檢測，結(jié)果表明，取食成熟葉片的木虱獲菌率最高，平均為66.67%，嫩梢次之，平均為33.33%，老葉部位的獲菌效率最低，平均僅為10.00%.病樹3 個部位飼菌后柑橘木虱平均獲菌率相互之間差異顯著(P＜0.05)，表明吸食部位與獲菌效率有關(guān)(表1).

2.2 柑橘木虱取食酸橘病苗的獲菌效率

木虱取食酸橘病苗的嫩梢、成熟葉和老葉3 個部位的獲菌效率比較結(jié)果表明，取食老葉獲菌率最高，平均為60.00%，成熟葉片次之，平均為43.33%，嫩梢部位的獲菌效率最低，平均僅為6.67%.取食老葉和成熟葉片的獲菌效率差異不顯著(P＞0.05)，但兩者都顯著高于嫩梢(P＜0.05)，表明吸食部位與獲菌率相關(guān)(表1).

2.3 柑橘木虱取食馬水橘、酸橘病苗獲菌效率的比較

柑橘木虱在馬水橘病苗上的獲菌效率由高到低的順序為:成熟葉片＞嫩梢＞老葉，而在酸橘上為:老葉＞成熟葉片＞嫩梢.說明飼菌部位與獲菌效率有關(guān)，但在2 個品種上的結(jié)果不一致.2 個品種在相同部位的比較結(jié)果，在馬水橘嫩梢上的獲菌效率顯著高于酸橘，而在馬水橘老葉上的獲菌效率則顯著低于酸橘(表1).在2 個品種成熟葉片上的差異不顯著，在全部3 個部位上取食后平均每株獲菌率差異也不顯著，均為36.67%.2 個品種不同部位飼菌結(jié)果的差異可能與病原在不同部位的濃度以及木虱對該部位的取食行為有關(guān).

表1 柑橘木虱取食黃龍病酸橘與馬水橘的不同部位獲菌效率比較1)Tab．1 Comparisons of bacterium acquisition efficiency of Asian citrus psyllid feeding on different parts of huanglongbinginfected Citrus reticulata and Citrus sunki

3 討論與結(jié)論

柑橘黃龍病病原菌是一種韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性菌，在韌皮部內(nèi)分布不均勻，同一株樹各枝各梢發(fā)病癥狀、時間呈現(xiàn)也不同［17］.本試驗結(jié)果證明了柑橘木虱吸食病樹的老葉、成熟葉、嫩梢其獲菌率有顯著差異，說明吸食部位與獲菌效率密切相關(guān).

但是吸食部位與獲菌效率在馬水橘、酸橘這2個品種上的表現(xiàn)不一致.吸食馬水橘3 個部位的獲菌效率由高到低的順序為:成熟葉＞嫩梢＞老葉，而酸橘為:老葉＞成熟葉＞嫩梢.這種差異可能與病原在2 個品種各個部位的濃度差異有關(guān).Li 等［18］的研究結(jié)果表明，黃龍病病原菌的濃度在不同染病柑橘品種上、同一品種不同植株、同一染病植株的不同部位上差異很大，在自然染病的植株地上部分組織(包括葉中脈、葉片和樹皮)中每1 g 樣本平均有1010個病菌基因組，部分取自相同植株的根部樣本中也檢測到相似的病原濃度水平，其中植株中下部的葉片病原濃度高于頂部嫩葉.Kunta 等［19］比較了德克薩斯州感染黃龍病的葡萄柚Citrus paradisi Macf 和甜橙Citrus sinensis(L.)Osbeck 果柄、果軸、種子、葉片中脈、葉片(除去中脈)、葉邊緣、嫩葉、嫩梢、花蕾、花、樹干的病原濃度，發(fā)現(xiàn)果柄、果軸、葉片中脈上的濃度顯著高于其他部位，嫩梢上的濃度最低.這2 個研究結(jié)果均顯示成熟的葉片比嫩梢或嫩葉病原濃度高，與本試驗結(jié)果中取食成熟葉片的獲菌效率高于嫩梢相吻合.

柑橘木虱吸食黃龍病馬水橘老葉的獲菌效率則顯著低于嫩梢和成熟葉片，而吸食酸橘老葉獲菌率則顯著高于嫩梢，除了可能與病原在2 個品種的分布不同有關(guān)之外，還可能與兩者老葉的成熟度、木虱的趨性、葉片的營養(yǎng)和吸食時間有關(guān).木虱具有趨嫩性，在有嫩梢的條件下一般不選擇老葉取食，盡管本試驗中2 個品種各部位的飼毒時間均為24 h，但在此期間木虱在各部位的取食時間可能不同.楊成良等［20］用刺吸電位圖譜技術(shù)測定了柑橘木虱在健康柑橘上吸食嫩葉的過程，在記錄的8 h 中木虱口針有74%的時間均在韌皮部吸食，但是如果在感染黃龍病的柑橘上取食，木虱口針的路徑波和分泌唾液波時間會顯著延長，而在韌皮部的吸食時間顯著減少［21］，說明柑橘感染黃龍病后增加了木虱取食的障礙.2 個品種老葉上獲菌效率的差異有待于進一步用EPG 進行驗證.

柑橘木虱取食馬水橘、酸橘病苗的嫩梢和老葉2個部位時，2 個品種之間獲菌效率差異達(dá)到顯著水平，在成熟葉片之間的獲菌效率則比較穩(wěn)定，2 個品種之間差異不顯著，但均顯著高于嫩梢.因此，在柑橘上取樣檢測黃龍病時建議采集成熟葉片.

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