仝明薇，易 立，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染幼犬引起的一種急性傳染病，發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)，病程短，病死率高［1-4］，是危害我國犬養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一，可造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。犬細(xì)小病毒于1978年由美國學(xué)者從犬糞便樣品中首次分離獲得［5］。1982年梁士哲和徐漢坤相繼報(bào)道了國內(nèi)的犬細(xì)小病毒流行情況。細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus）［6］，病毒粒子在電鏡下呈圓形或六邊形，無囊膜，核衣殼為軸對稱的20面體。細(xì)小病毒為線狀單股負(fù)鏈的DNA病毒，基因組含有5 323個(gè)核苷酸［7］。在抗原性上與非致病性微小病毒（Minute virus of canine，MVC）有顯著差異，而被命名為 CPV-2［8］。CPV 只有一個(gè)抗原型，即 CPV-2，在其出現(xiàn)后不斷發(fā)生抗原漂移，目前已有多個(gè)亞型，分別為 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）及 CPV-2c（b）［9-11］。

由于CPV具有很快的變異速度，現(xiàn)在臨床使用的滅活疫苗與弱毒疫苗的免疫效果都有不同程度下降。因此，針對當(dāng)前流行的CPV毒株進(jìn)行研究分析，為制備更有效的疫苗奠定一定的理論基礎(chǔ)，對防控犬細(xì)小病毒病，促進(jìn)犬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。本研究根據(jù)GenBank中已登錄的CPV序列，利用重疊PCR技術(shù)從CPV分離株中提取的DNA，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 試驗(yàn)用病料為吉林省長春市某犬養(yǎng)殖場疑似細(xì)小病毒癥狀犬的糞便，收集病料共16份，置-80℃保存?zhèn)溆??！?/p>

1.1.2 主要試劑 StoolGen DNA Kit、Universal DNA Purification Kit為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；EsTaqDNA polymerase為 TaKaRa公司產(chǎn)品；F81細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 犬細(xì)小病毒分離 取病料（0.2g），用 EMEM細(xì)胞營養(yǎng)液10倍稀釋，上下顛倒充分混勻，5 000r／min離心20min，取上清，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾后，置-20℃凍存?zhèn)溆?。將處理好的樣品按培養(yǎng)液體積的1／10接種于F81細(xì)胞系（由本實(shí)驗(yàn)室保存），同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照，37℃吸附30min，加生長液繼續(xù)于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下靜置培養(yǎng)4d～5d，每天觀察細(xì)胞貼壁生長情況及有無細(xì)胞病變。如無病變則于培養(yǎng)的第4d～5d收取上清，細(xì)胞繼續(xù)按常規(guī)傳代培養(yǎng)，至第5代仍無病變視為分離陰性；出現(xiàn)細(xì)胞病變的經(jīng)-20℃／37℃反復(fù)凍融3次收毒，置-20℃保存。

1.2.2 病毒基因組DNA的提取 病料DNA提取參考Stool Gen DNA Kit，提取的 DNA 用無核酸酶的水溶解，置-20℃保存。

1.2.3 犬細(xì)小病毒部分基因片段的PCR擴(kuò)增 參照GenBank上已登錄的犬細(xì)小病毒（登錄號為：EU310373）基因組保守區(qū)應(yīng)用Premier 5.0設(shè)計(jì)一對引物：上游引物：5′-ATCTGAGACATTGGGTTT-3′，下游引物：5′-TTTCTAGGTGCTAGTTGA-3′。兩個(gè)引物間理論的PCR產(chǎn)物為1 105bp，由Invitrogen（上海）公司合成。PCR采用25μL反應(yīng)體系：10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL、上、下游引物各1μL，EsTaq酶0.5μL，模板2μL，ddH2O 16μL，95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min 15s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 克隆片段的序列測定 將PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司（上海）進(jìn)行測序分析。隨后利用Gen-Bank中的Blast分析軟件包對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，以確定所擴(kuò)增序列為犬細(xì)小病毒基因組序列。

1.2.5 犬細(xì)小病毒全基因組序列重疊PCR擴(kuò)增根據(jù)克隆片段的測序結(jié)果，設(shè)計(jì)了5對引物（圖1）用于克隆病毒基因組的全基因序列。引物序列分別如下：P1：5′-GTGGCGGGCTAATTGTGG-3′；P2：5′-TGTTTGCTTATGTCTGTATGTT-3′； P3： 5′-GGTGACTCTTTGTTCGGTAA-3′；P4：5′-GCTTGTGCTATGGCTTGA-3′；P5：5′-ACGGATGGAATTGGATTA-3′；P6：5′-ACCAGAGCGAAGATAAGC-3′；P7：5′-CGCTGCTTATCTTCGCTCTG-3′；P8：5′-TTCATCTGTTTGCGCTCCC-3′；P9：5′-CTCAAATGGGAAATACAAAC-3′； P10： 5′-ATTCTAAGGGCAAACCAA-3′

圖1 病毒基因組全序列重疊PCR引物簡圖Fig.1 The map of overlapping PCR primers of virus genome

5對引物間理論的PCR產(chǎn)物分別為696、771、1 133、1 396、1 045bp。PCR采用50μL反應(yīng)體系：10×buffer 5μL，dNTPs 5μL，上、下游引物各2μL，EsTaq酶 0.5 μL，模 板 4 μL，ddH2O 31.5μL，95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min 30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并在紫外燈下切割目的片段，然后用Universal DNA Purification Kit回收試劑盒進(jìn)行回收和純化，并送Invitrogen公司（上海）進(jìn)行測序分析。

1.2.6 病毒基因組測序結(jié)果的整理與分析 將所獲得的5次測序結(jié)果用DNA Star軟件包中的Editseq、Seqman等程序進(jìn)行整理、校對，并拼接成線性全基因組序列，最后運(yùn)用分子生物學(xué)軟件分析該病毒基因組與細(xì)小病毒科其他病毒的基因組遺傳變異情況等。

2 結(jié)果

2.1 犬細(xì)小病毒分離

將采集的病料接種于F81細(xì)胞，應(yīng)用同步接毒和帶毒傳代的方法分離獲得了1株犬細(xì)小病毒，命名為JL-M13。與正常細(xì)胞（圖2A）相比，JL-M13在F81細(xì)胞連續(xù)傳代3次即出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變大，細(xì)胞融合成圓形或橢圓形大融合細(xì)胞，細(xì)胞間隙變大并成“拉網(wǎng)狀”（圖2B）。

圖2 細(xì)胞觀察結(jié)果Fig.2 The results of cell observation

2.2 病毒基因組部分片段的PCR擴(kuò)增

病毒基因組部分片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察到一條大小約1 105bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。測序后經(jīng)Blast分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank中犬細(xì)小病毒CPV-2毒株（EF011664.1）的同源性高達(dá)99.6%，利用測序結(jié)果設(shè)計(jì)5對引物，擴(kuò)增病毒基因組全基因序列，經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳后得到大小分別約為696、771、1 133、1 396、1 045bp 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖3），PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后直接進(jìn)行測序。

2.3 病毒基因組的測序結(jié)果及分析

將5次測序結(jié)果運(yùn)用分子生物學(xué)軟件拼接后表明，該病毒基因組全長4 621bp，分析表明，JL-M13為Type-2型細(xì)小病毒。基因組包含2個(gè)ORF。ORF1編碼2種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2），ORF2編碼2種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1和VP2）。

2.4 病毒基因組的遺傳變異分析

圖3 JL-M13病毒基因組部分片段的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of viral genome of JL-M13strain

利用生物學(xué)軟件，對所獲得細(xì)小病毒JL-M13毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)小病毒參考毒株的基因組構(gòu)建進(jìn)化樹表明（圖4），本研究中所獲的JL-M13毒株與CPV-2-SC02／2011毒株和CPV-s5毒株同屬于CPV-2型，并在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上與四川株SC02／2011非常接近，這暗示本次獲得的犬細(xì)小病毒毒株與四川流行株SC02／2011有著極其緊密地關(guān)系。

將該病毒基因組與細(xì)小病毒科中其他細(xì)小病毒基因組進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，從不同動物中分離得到的細(xì)小病毒，其同源性差異較大。所獲的JL-M13毒株與番鴨細(xì)小病毒（MPV）同源性最低，為30.8%；與豬細(xì)小病毒（PPV）和牛細(xì)小病毒（BPV）的同源性也較低，為33.8%～41.3%；與鼠細(xì)小病毒（MMV）同源性為66.2%；與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（FPV）、貂腸炎病毒（MEV）、犬細(xì)小病毒（CPV）的同源性均在98.0%以上，其中與病毒株CPV-2同源性高達(dá)99.6%（圖5）。

圖4 JL-M13病毒基因組遺傳進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of JL-M13virus genome

圖5 JL-M13病毒基因組同源性分析Fig.5 Homological analysis of JL-M13genome

3 討論

細(xì)小病毒由于自身所帶基因限制，其復(fù)制增值病毒前期所需的酶均要宿主細(xì)胞的幫助，這就要求宿主細(xì)胞必須處于對數(shù)生長期，故細(xì)小病毒培養(yǎng)多采用同步接毒的方法。本研究所獲的細(xì)小病毒毒株（JL-M13），全長4 621bp，包括2個(gè) ORF，ORF1編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2），ORF2編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1和VP2），這與其他細(xì)小病毒類似。將JL-M13毒株與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)小病毒參考毒株的基因組構(gòu)建進(jìn)化樹表明，該毒株屬于CPV-2型，并與2011年分離的四川株SC02／2011有較密切的關(guān)系，這是否暗示著近年來犬細(xì)小病毒由南至北的流行還有待進(jìn)一步研究。

病毒基因組同源性分析表明，從不同動物中分離得到的細(xì)小病毒，其核苷酸同源性差異很大。JLM13，與番鴨細(xì)小病毒同源性最低，為30.8%；與豬細(xì)小病毒、牛細(xì)小病毒和鼠細(xì)小病毒的同源性也較低，為33.8%～66.2%；與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒、貂腸炎病毒、犬細(xì)小病毒的同源性均在98.0%以上，其中與病毒株CPV-2同源性高達(dá)99.6%。由此可見細(xì)小病毒在不同動物間有較為嚴(yán)格的種屬特性。

細(xì)小病毒自1978年由美國學(xué)者首次分離報(bào)道后，已不斷在抗原性、宿主范圍和血凝性等方面發(fā)生變異，并已出現(xiàn)多個(gè)亞型。其感染宿主也由主要感染犬科動物到已證實(shí)的CPV-2a、CPV-2b在自然條件下也能感染貓科、鼬科等多種肉食獸［12］。CPV-2a、CPV-2b被發(fā)現(xiàn)后很快取代了最初的CPV-2，二者一般呈混合感染，而應(yīng)用單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的CPV-2c［13］與 CPV-2a、CPV-2b一樣，也在世界范圍廣泛分布，并有逐漸取代其他型的趨勢。我國的CPV分離株沒有形成明顯的中國CPV分支，在中國臺灣，先前的報(bào)道CPV-2a占優(yōu)勢地位，WANG H G等［1］研究發(fā)現(xiàn)在臺灣中部卻以CPV-2b為主。易立等2009年研究報(bào)道，武漢、南京和北京等城市寵物犬中流行的犬細(xì)小病毒CPV-2a亞型毒株單獨(dú)構(gòu)成一簇，并且與2008年的韓國分離株K001關(guān)系緊密，而與早期其他地區(qū)的犬細(xì)小病毒CPV-2a亞型流行株距離較遠(yuǎn)，預(yù)示著犬細(xì)小病毒流行株的變異具有某種時(shí)間和空間相關(guān)性。本研究對犬細(xì)小病毒流行毒株的基因組序列及其變異規(guī)律，同源性等進(jìn)行分析，為生產(chǎn)實(shí)踐中免疫失敗尋找原因提供基礎(chǔ)，為有針對性地采取有效的防控措施，積極防控該病提供重要參考。

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