劉 龍

（鄭州大學體育學院，河南鄭州 450044）

超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）作為細胞中的一種抗氧化酶，在生物體清除氧自由基方面發(fā)揮著重要作用。氧自由基在生物體內如果堆積過多，會造成細胞膜上脂質發(fā)生過氧化，脂質過氧化會導致細胞膜的正常結構和功能遭到破壞，并進一步會導致蛋白質的交聯(lián)和變性，導致生物體內許多酶類和激素失去活性。氧自由基堆積過多還會破壞核酸的正常結構。最終使機體代謝出現異常，出現一種退行性的變化，從而導致了衰老現象的發(fā)生［1－3］。SOD可以有效清除機體內的有害自由基，及時修復受損傷的細胞和蛋白質，對減緩機體衰老起著很重要的調控作用［4］。研究表明，衰老大鼠睪丸組織中包含SOD在內的一些抗氧化酶活性均顯著降低［5］。睪丸組織中含有的SOD含量下降，還會導致細胞內的抗氧化作用和氧化作用之間的平衡出現失調，并最終導致自由基的堆積，加速衰老［6］。適度運動可以通過各種體制提高機體內的SOD含量，從而清除體內的自由基，延緩衰老的發(fā)生［7］，運動通過影響外周血和生殖系統(tǒng)器官內SOD的含量對有機體的新陳代謝起著重要的調控作用。

現今關于運動與衰老的試驗研究也有一定的報道，但大都側重于男性生殖系統(tǒng)與衰老的研究，有關適度運動對外周血和女性生殖系統(tǒng)器官組織中SOD的影響及其與衰老的研究至今未見報道。本研究運用免疫組化SP法檢測了雌性大鼠卵巢中SOD的表達并進一步檢測了大鼠血清中SOD的濃度，為進一步探討運動與SOD的調控衰老提供了形態(tài)學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康青春期雌性SD大鼠，體重240g～250g為河南省實驗動物中心產品；兔抗鼠SOD多克隆抗體為南京建成生物所產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 將SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)管理，1周后用于試驗。并隨機分為對照組、20、40、60、80min運動組，共5個試驗組。運動形式為游泳，對照組大鼠不運動，試驗組大鼠每天分別運動20、40、60、80min。每日進行1次運動，每周運動5d，試驗時間為20周。

1.2.2 取材及切片 各試驗組訓練20周后40mL／L的水合氯霉醛腹腔麻醉處死實驗動物，頸動脈取血，制備血清備用。同時取各試驗組大鼠卵巢，并迅速置于4℃質量分數為40mL／L的多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h～24h后。對固定的卵巢做石蠟切片進行免疫組化染色，切片片厚5μm，取其中的2套。第1套行進行免疫組化SP法染色；第2套用PBS代替一抗，作為對照。

1.2.3 主要試劑及免疫組化操作程序 一抗為兔抗鼠SOD多克隆抗體（1∶100稀釋，為武漢博士德生物工程有限公司產品），切片脫蠟復水，按抗體要求和試劑盒操作說明進行免疫組化操作。最后用梯度乙醇脫水干燥后，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照切片染色按照免疫組織化學SP法的染色步驟進行處理，只是把步驟中加入的兔抗大鼠SOD抗體用PBS液代替，其余步驟完全相同，陰性對照用0.01mol／L的PBS緩沖液代替一抗，用DAB顯色，然后貼片，進行梯度酒精脫水，用二甲苯透明后置于顯微鏡下觀察。

1.2.4 結果判斷及統(tǒng)計學處理 SOD測定時，設空白管（不加亞硝酸鈉和標本）、標準管（加入20μmol／L的亞硝酸鈉）和測定管，往測定管內加0.3mL的待測血清。各管混勻放置10min后，3 500r／min～4 000r／min離心10min，然后取上清液0.8mL，37℃恒溫水浴40min，加入顯色劑混勻，10min以后倒入1cm的光徑比色杯中，用蒸餾水調零，用酶標儀于波長550nm處比色。并按公式［SOD活力NU／mL（亞硝酸鹽單位／mL）＝（A對照管－A測定管）÷A對照管÷50%×稀釋液倍數］，計算SOD活力［8］。免疫組化反應中有藍色顆粒者為陽性，切片中陰性表達的細胞質不顯色。圖片分析時隨機選取10個相同部位不同切片的高倍鏡視野（400×），用江蘇捷達高清晰的圖像分析系統(tǒng)分析，并計算出每一個視野的陽性強度均值（陽性強度均值用平均吸光度表示）和陽性面積，然后計算出相對的表達量μ2均值（μ2＝光鏡倍數×陽性強度均值×陽性面積／260 000）［8］，公式中260 000表示像素。最終計量資料應用均值±標準差（ˉx±SD）表示，統(tǒng)計學應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用t檢驗法比較出各組大鼠卵巢中SOD的表達，P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 SOD濃度測定結果

與對照組相比，20min運動訓練組與0min運動組相比無顯著性差異，80min運動訓練組大鼠血清中SOD濃度較低而差異顯著（P＜0.05）；40min和60min運動組大鼠血清中SOD的濃度與對照組相比較高而差異顯著（P＜0.05）同時，40min運動訓練組與60min運動訓練組之間差異不顯著（P＞0.05），但二者分別與20min運動訓練組和80min運動訓練組之間有顯著性差異（P＜0.05）（表1）。

表1 運動對大鼠血清中SOD濃度的影響Table 1 Effect of exercise on SOD concentration in the serum of rats

2.2 SOD在不同運動組大鼠卵巢中的表達結果

在對照組大鼠卵巢黃體的顆粒性黃體細胞中SOD免疫反應陽性產物為藍色強陽性表達，陽性胞體內深藍色的陽性表達產物融合為團狀，陽性顆粒染成一片，陽性細胞體間的輪廓清晰，陽性細胞中陽性產物定位在胞膜和部分胞質，胞核不著色呈現空泡狀（圖1A）。40min和60min運動組大鼠的顆粒性黃體細胞中SOD免疫反應陽性產物呈現藍黑色的強陽性表達，陽性細胞多為聚集或分散存在，陽性細胞呈不規(guī)則的圓形、卵圓形以及梭形等（圖1C和圖1D）。在20min和80min運動組大鼠的卵巢粒性黃體細胞中SOD免疫反應陽性產物均呈藍色的弱陽性表達，陽性表達的細胞體輪廓模糊不清，用高倍鏡才可以看到陽性細胞中含有少量的淺藍色陽性顆粒。陽性表達的細胞體多為不規(guī)則的圓形和卵圓形（圖1B和圖1E，表2）。

表2 SOD在不同實驗組大鼠卵巢中的表達Table 2 The expression of SOD in the ovary of exprimental rats

圖1 SOD在不同運動組大鼠卵巢中的表達Fig.1 The expression of SOD in the ovaries of different groups of rats

3 討論

SOD作為生物體內的重要抗氧化酶，可清除細胞代謝過程中所產生的氧自由基，并可以降低氧自由基對細胞造成的損害，從而與機體的衰老機制的調控密切相關［9－10］。運動本身可以對機體造成一種刺激，這種刺激會導致機體的功能和內環(huán)境發(fā)生不同程度的應激，運動時間長短不同，對應激反應的強弱也有一定的差異。本試驗結果表明，大鼠短時間運動20min后，其血液中SOD的濃度與0min運動組相比略有增高而差異不顯著，說明，短時間運動不能達到機體的應激反應閾值，對機體衰老也不會產生影響。但是隨著大鼠運動時間開始增加，每日的運動時間增加到40min，甚至增加到60min，大鼠血清中SOD濃度與對照組相比含量增高而有顯著性差異（P＜0.05）這一研究結果提示，適當的運動可以促使有機體產生一些有利的應激反應，使細胞內產生大量的SOD，提高了細胞對氧自由基的清除作用，從而對機體起到了抗衰老的作用［11］。當大鼠每日運動時長增加到80min，血液中SOD濃度與0min運動組相比卻沒有隨著運動時間的延長而濃度增高，而是出現了明顯的降低（P＜0.05），提示，長時間運動會使機體應激過度而處于比較疲憊狀態(tài)，使得機體失去代償狀態(tài)的大量細胞不能產生相應濃度的SOD，并導致細胞內大量氧化物堆積而不能及時清除，不但不能對衰老起到延緩作用，還會對機體產生一定程度的損傷作用。

運動本身是一種強烈的刺激性活動，會造成機體的耗氧和耗能增加，而產生一定的自由基。SOD在清除氧自由基過程中會大量消耗，有機體則可以通過正反饋調節(jié)機制增強細胞SOD的表達。在本研究中，20min運動組卵巢黃體中SOD的表達與對照組之間無顯著性的差異（P＞0.05）。提示，隨著大鼠運動時間的增加，機體相應的會提高SOD的表達以應對其不斷的消耗，但由于運動時間較短，體內產生的氧自由基數量較少，短時間不能達到反饋調節(jié)閾值，因此，SOD的水平沒有增加。隨著運動時間的進一步增加，當增加到40min和60min時，細胞在耗氧和耗能過程中會產生大量氧自由基，細胞內儲存的SOD會消耗殆盡。為平衡機體代謝，細胞會做出相應的調節(jié)［12］，以提高SOD的表達，增加細胞SOD的含量，減少氧自由基的損傷［13－14］。但是，隨著運動時間的進一步增加，當運動時間增加到80min時，運動訓練組大鼠較對照組卵巢黃體中SOD水平有所降低而差異顯著（P＜0.05）。長時間運動會導致細胞內SOD水平消耗過多，或者是由于清除氧自由基會消耗大量SOD，使其在體內的含量降低。

綜上所述，當機體受到運動刺激時，細胞內會迅速產生大量氧自由基，消耗了細胞內儲存的SOD。隨著運動時間的延長，細胞耗氧耗能增加，最終導致胞內儲存的SOD消耗殆盡，細胞開始出現一系列適應性反應，以增加細胞內SOD的水平，減少氧自由基對機體的損傷，隨著運動時間的進一步延長，有機體開始處于過度疲憊狀態(tài)，機體內失去代償狀態(tài)的大量細胞不能產生足夠的SOD，使機體內SOD水平下降，最終導致細胞內的過氧化物堆積和細胞損傷。

［1］Itoh M，Oh－ishi S，Hatao H，et al.Effects of dietary calcium restriction and acute exercise on the antioxidant enzyme system and oxidative stress in rat diaphragm［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287：33－38.

［2］Mitsuoka H，Unnon N，Sakurai T.Pathophysiological role of endothelins in pulmonary microcirculatory disorders due to intestinal ischemia and reperfusion［J］.J Surg Res，1999，87（2）：143－151.

［3］卞龍艷，蔣 丹，林 芳.運動對成年小鼠肌肉氧自由基和自噬水平的影響［J］.蘇州大學學報：醫(yī)學版，2012，32（4）：510－513.

［4］Ye N，Liu S，Lin Y，et al.Protective effects of intraperitoneal injection of TAT－SOD against focal cerebral ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Life Sci，2011，89（23／24）：868－874.

［5］公鐵紅，付淑華，牛嗣云，等.衰老大鼠睪丸組織SOD、MDA和血清睪酮含量的變化［J］.承德醫(yī)學院學報，2012，29（1）：14－16.

［6］蔡崇岳，章振保，田生平.衰老雄性大鼠睪丸組織抗氧化酶與血清睪丸酮水平、凋亡蛋白酶－3基因表達的研究［J］.汕頭大學醫(yī)學院學報，2006，19（3）：154－157.

［7］李芳暉，楊海平，王景貴，等.去乙?；?介導衰老相關疾病的發(fā)病機制及其與運動的關系［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2012，31（11）：1014－1020.

［8］胡昌東，歸綏琪.自然流產患者滋養(yǎng)細胞肝素表皮生長因子的表達和意義［J］.上海醫(yī)學，2004，27（7）：491－494.

［9］項紅軍，趙佐慶，李紀鵬，等.大鼠小腸缺血再灌注后血中NO，SOD濃度及肺中Bax，Bcl－2表達的改變［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2002，23（21）：1974－1977.

［10］Flint A C，Kame H，Navi B B，et al.Statin use during ischemic stroke hospitalization is strongly associated with improved poststroke surviva［J］.Stroke，2012，43（1）：147－154.

［11］Hollander J，Fiebig R，Ookawara T，et al.et al.Superoxide dismutase gene expression is activated by a single bout of exercise in rat skeletal muscle［J］.Eur J Physiol，2001，442（3）：426－434.

［12］Ji L L，Dillon D，Wu E.Alteration of antioxidant enzymes with aging in rat skeletal muscle and liver［J］.Am J Physiol，1990，258（4）：918－923.

［13］Hatao H，Oh－ishi S，Itoh M，et al.Effects of acute exercise on lung antioxidant enzymes in young and old rats［J］.Mech Ageing Dev，2006，127（4）：384－390.

［14］AmeLIE Rebillard，Luz Lefeuvre－Offila，Jordan Gueritat，et al.Prostate cancer physical：Adaptive response to oxidative stress［J］.Free Radical Biol Med，2013，60：115－124.