楊 倩，朱道中，薛春宜，李曉明，曹永長＊，段燕喻，王 瑩，吳曉薇，劉志玲

（1.中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006；2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州 510623；3.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京 102206）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒屬的流感病毒引起的一種禽類重要傳染性疫病。該病于1878年首次報道于意大利，自從1959年高致病性AI首次報道以來，全世界共暴發(fā)了32次，每次都給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失，其中較為受關注的有1959年英格蘭H5N1亞型AI、1994年墨西哥AI、1997年香港AI、2004年亞洲 H5N1亞型AI及2013年倍受關注的H7N9亞型AI事件［1］。該病影響范圍大，對人、畜、禽的健康均構成了極大的威脅。目前根據(jù)禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）致病性的不同，可分為高致病性AIV、低致病性AIV和非致病性AIV 3大類。迄今為止，高致病性AI基本是由H5亞型或H7亞型AIV引發(fā)的［2］。為了有效地防控AI，國內(nèi)外政府與學者給予了該病極大的關注。

AIV的一個重要的結(jié)構蛋白血凝素（HA）是大小為75ku的糖蛋白，具有凝集部分動物紅細胞的功能，是主要的表面抗原?；|(zhì)蛋白（M）包括2個蛋白M1和M2，其中M1蛋白是病毒顆粒的主要組分，與病毒的組裝和出芽相關［3］。病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）是含有特定病毒的一個或多個結(jié)構蛋白的空心顆粒，內(nèi)部不含病毒核酸物質(zhì)，在形態(tài)結(jié)構和大小上與真實的病毒粒子類似，具有與完整病毒類似的免疫原性和免疫反應性［4］。流感病毒的結(jié)構蛋白可以相互作用，形成流感VLP。本研究的VLP是利用流感病毒HA和M1兩個結(jié)構蛋白形成的。

對于流感病毒VLP的應用主要在疫苗研制領域和免疫測定領域。在疫苗研制方面，因為VLP疫苗既避免了病毒的感染性，又具有疫苗的有效預防的可能性，因此較為理想?，F(xiàn)已報道的有H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H5N3及 H9N2亞型流感病毒VLP，動物試驗證明這些流感病毒VLP可誘導產(chǎn)生保護性免疫應答反應?，F(xiàn)階段研究表明，流感病毒VLP疫苗可誘導產(chǎn)生較高的免疫效價，并且可誘導產(chǎn)生交叉免疫反應，同時不含核酸安全性較高。但目前研究大多停留在動物試驗和臨床前試驗的階段?，F(xiàn)在VLP在免疫測定中也有了一定得應用，主要包括在抗體檢測的應用和抗原檢測的應用。

傳統(tǒng)意義上的脂質(zhì)體亦稱類脂小球，它是由磷脂雙分子定向排列而成的，其直徑約為幾微米至幾毫米，是人工制備的顆粒，其組成包括不溶性的極性的磷脂質(zhì)和膽固醇等附加劑。由于其制備簡單、安全性高、靶向性高、無免疫原性反應等受到人們的廣泛重視。利用重組桿狀病毒感染宿主細胞，病毒大量出芽后，會導致宿主細胞的細胞膜破裂，破碎的細胞因疏水作用而形成“球狀”，將其稱為類病毒脂質(zhì)體。現(xiàn)在關于類病毒脂質(zhì)體的研究還停留在初期階段，因此希望進行更加深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞和培養(yǎng)基 重組的 A／Harbin／Re-1／2003（H5N1Re-1）滅活禽流感病毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所贈送，含有 A／goose／Guangdong／1／96（H5N1）的HA和NA片段，其他6個片段來自A／Puerto Rico／8／1934（H1N1）。

pFastBacDual-HA和pFastBacDual-HA-M1質(zhì)粒和Sf9細胞由中山大學生命科學學院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室構建和保存；Grace培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；Sf-900ⅡSFM 為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.1.2 ELISA所用試劑和器材 包被緩沖液，洗滌緩沖液，封閉液，稀釋緩沖液，底物緩沖液，顯色緩沖液，終止液；96孔平底聚苯乙烯酶標板為Greiner公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組桿狀病毒的構建 將pFastBacDual-HA和pFastBacDual-HA-M1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10β感受態(tài)細胞，進行轉(zhuǎn)座反應，然后經(jīng)藍斑篩選和抗生素篩選，獲得相應質(zhì)粒并利用PCR技術對轉(zhuǎn)座質(zhì)粒（rBacmid）進行鑒定。參考Invitrogen公司Bac-To-Bac表達系統(tǒng)技術手冊，將質(zhì)粒（rBacmid-HA、rBacmid-HA-M1）和 Cellfectin?Ⅱ Reagent脂質(zhì)體混合，接種于對數(shù)生長期的Sf9細胞，然后置于28℃培養(yǎng)5h后，棄去原混合物并用新鮮的培養(yǎng)基洗滌2次，然后加入Grace完全培養(yǎng)基，28℃繼續(xù)培養(yǎng)72h，收獲培養(yǎng)基和細胞，上清即為P1代重組病毒，4℃保存?zhèn)溆?。用P1重組病毒感染Sf9細胞進行擴大培養(yǎng)，蝕斑鑒定種毒滴度，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 H5N1亞型 AIV VLP的制備、純化和鑒定 將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA-M1以5mol感染昆蟲細胞。28℃，培養(yǎng)72h后，收獲上清。10 000r／min、4℃離心30min，收集上清液，然后將上清液，40 000r／min、4℃離心2h，收集沉淀用PBS重懸。將PBS重懸液上樣于200g／L～600g／L梯度蔗糖液面上，27 000r／min、4 ℃離心2h，吸取病毒條帶，然后40 000r／min、4℃離心1h脫糖，用適量PBS重懸沉淀。通過血凝試驗檢測獲得的純化的AIV VLP的血凝活性，通過透射電鏡觀察形態(tài)，鑒定是否與真實流感病毒顆粒具有相似的構象。

1.2.3 H5N1亞型AIV類病毒脂質(zhì)體的制備和鑒定 將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA-M1以5mol感染昆蟲細胞，28℃培養(yǎng)72h后，收獲細胞。將細胞用PBS洗滌3次，離心后取沉淀。將沉淀用200μL預冷的PBS重懸，反復凍融3次后在冰水浴中采用超聲波破碎30min，然后靜置10min，最后3 000r／min離心5min，取上清進行鑒定。鑒定方法同VLP。

1.2.4 H5N1亞型AIV HA蛋白的制備和鑒定將純化后的重組桿狀病毒rBacmid-HA以MOI為5感染昆蟲細胞，28℃，培養(yǎng)72h后，收獲細胞。將細胞用PBS洗滌3次，離心后取沉淀。向沉淀加入200μL細胞裂解液，混勻，然后在冰上靜置30min，3 000r／min離心5min，取上清。通過SDS-PAGE和血凝試驗進行鑒定。

1.2.5 最適抗原包被濃度和對照血清最佳稀釋度的確定 以單獨表達的HA蛋白、類病毒脂質(zhì)體、VLP分別作為抗原進行包被。采用方陣試驗確定最適抗原包被濃度和血清最佳稀釋度?？乖冒灰哼M行稀釋，每100μL含抗原量分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120ng，然后分別加入酶標板內(nèi)，100μL／孔，4℃包被過夜；洗滌后用封閉液37℃封閉1h；再次洗滌后，將陰、陽性血清用稀釋液分別作1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋，加入相應的孔內(nèi)，100μL／孔，同時設空白對照，37℃溫育1h；用洗滌液洗滌3次，然后加入驢抗雞IgG-HRP（1∶5 000稀釋），100μL／孔，37 ℃溫育1h；再次洗滌后加顯色液，100L／孔，37℃溫育10min，2mol／L H2SO4終止，50μL／孔，將酶標板置于450nm處讀取OD值。取陽性血清孔的OD值接近1.0，陰性血清孔OD值小于0.2，P／N最大的血清稀釋度作為抗原及血清的最適工作濃度。

1.2.6 間接ELISA臨界值的判定 間接ELISA方法的判定標準：取3種抗原樣品進行ELISA檢測。當（樣品OD450nm值-空白對照OD450nm值）／（陰性對照OD450nm值-空白對照OD450nm值）≥2.1時為陽性［5］。

1.2.7 特異性試驗 采用試驗建立的間接ELISA方法，分別用VLP、類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原對H1N1亞型流感病毒陽性血清、H3N2亞型流感病毒陽性血清、H9N2亞型流感病毒陽性血清、新城疫陽性血清以及H5N1亞型AIV陽性血清和陰性血清進行檢測，比較檢測結(jié)果。

1.2.8 敏感性試驗 取3份H5N1亞型AIV陽性血清，進行系列稀釋后，分別采用VLP、類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原進行檢測，記錄各陽性血清在不同方法的檢測終點（陽性反應最高稀釋度），比較對同一組樣品的檢測靈敏度（最高稀釋度）。

1.2.9 重復性試驗 取H5N1亞型AIV陽性血清和陰性血清各1份，用3個不同時間制備的VLP、類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白作為抗原進行3次檢測，分別計算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

1.2.10 保存穩(wěn)定性試驗 將包被用的抗原凍干成粉末，分別取置于37℃前、置37℃后4d和8d的樣品，按相同方法檢測同一份陽性和陰性血清，比較前后3個時間的檢測結(jié)果。

1.2.11 臨床樣品檢測 用本試驗建立的間接ELISA方法對100份疑似H5N1亞型AIV陽性的血清進行檢測。

1.2.12 血凝抑制試驗 分別用VLP、類病毒脂質(zhì)體和滅活H5N1亞型AIV制備4單位抗原。參照《禽流感檢疫技術規(guī)范》（SN／T1182—2010）［6］中的血凝抑制試驗方法對30份陽性血清及1份SPF雞陰性血清分別進行HI抗體檢測，比較不同抗原所測得的HI抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 抗原的鑒定

2.1.1 血凝試驗

2.1.1.1 VLP的血凝試驗 血凝試驗結(jié)果表明，10μg純化的VLP的HA效價為256，具有很強的凝集雞紅細胞的能力，說明HA組裝入VLP-HAM1以后，仍然保持血凝活性和正確的空間構象。

2.1.1.2 類病毒脂質(zhì)體的血凝試驗 血凝試驗結(jié)果表明，10μg類病毒脂質(zhì)體的HA效價為256，具有很強的凝集雞紅細胞的能力，說明禽流感病毒類病毒脂質(zhì)體有較高的血凝活性。

2.1.2 電鏡觀察

2.1.2.1 透射電鏡觀察病毒樣顆粒的形態(tài) 從圖1可以看出，表達的HA和M1形成的VLP直徑80nm～120nm，有明顯的刺突結(jié)構（HA蛋白），與流感病毒粒子相似。

圖1 H5N1AIV VLP電鏡觀察結(jié)果Fig.1 Observation of influenza H5N1AIV VLP by electron microscopy

2.1.2.2 透射電鏡觀察類病毒脂質(zhì)體的形態(tài) 從圖2可以看出，形成的類病毒脂質(zhì)體直徑約為20nm～30nm，呈球狀。

圖2 H5N1AIV類病毒脂質(zhì)體電鏡觀察結(jié)果Fig.2 Observation of influenza H5N1AIV virus-like liposomes by electron microscopy

2.1.3 重組HA的SDS-PAGE鑒定 HA基因大小為1 760bp，編碼一條由568個氨基酸組成的蛋白，分子質(zhì)量約為70ku。重組桿狀病毒rBacmid-HA感染Sf9細胞72h后，收獲細胞，用預冷的PBS洗滌后裂解，離心后取上清進行SDS-PAGE檢測，可以檢測到表達的HA（圖3）。

圖3 HA蛋白SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant HA protein expression

2.2 抗原最佳包被濃度與對照血清最佳稀釋度的確定

通過方陣試驗確定抗原最佳包被濃度為100ng／孔，H5N1亞型AIV血清最佳工作濃度為1∶500，二抗最佳稀釋度為1∶5 000。

2.3 間接ELISA臨界值的判定結(jié)果

通過隨機取抗原樣品進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，陰性對照于450nm下的OD值的平均值為0.120，空白對照的OD值的平均值為0.047。

2.4 特異性試驗

采用VLP、類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和滅活H5N1亞型AIV分別作為抗原對H1N1、H3N2、H9N2亞型流感病毒陽性血清、新城疫陽性血清及H5N1亞型AIV陰性血清檢測結(jié)果均為陰性，對H5N1亞型AIV標準陽性血清檢測結(jié)果為陽性。但是VLP作為抗原對H1N1亞型流感病毒陽性血清、H3N2亞型流感病毒陽性血清、H9N2亞型流感病毒陽性血清均為陽性，故無法區(qū)分不同亞型的流感病毒。結(jié)果如表1。

表1 不同抗原的特異性試驗結(jié)果Table 1 The results of specificity test with different antigens

2.5 敏感性試驗

分別以HA蛋白、VLP、類病毒脂質(zhì)體和滅活的H5N1亞型AIV作為抗原，檢測3份不同稀釋度的H5N1亞型AIV陽性血清，結(jié)果表明HA重組蛋白的敏感性稍低于其他3種物質(zhì)作為抗原的敏感性，結(jié)果如表2。

表2 四種抗原的敏感性試驗結(jié)果Table 2 The results of sensitivity test with four kinds of antigens

2.6 重復性試驗

以3個不同時間制備的VLP、類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白作為抗原進行3次檢測，獲得的批內(nèi)和批間系數(shù)均小于10%，結(jié)果表明用3種抗原建立的檢測方法重復性均較好（表3和表4）。

表3 批內(nèi)變異系數(shù)Table 3 The results of variation co-efficient within batch

表4 批間變異系數(shù)Table 4 The results of variation co-efficient between batchs

2.7 穩(wěn)定性試驗

比較前后3次檢測結(jié)果，結(jié)果表明無顯著差異（只列出其中一組數(shù)據(jù)）。按37℃放置1d相當于4℃放置1.6個月計算［5］，該試劑盒在4℃下至少可以穩(wěn)定保存1年。結(jié)果如表5。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 5 The results of stability tests

2.8 臨床樣品檢測

利用本試驗建立的間接ELISA方法對100份疑似H5N1亞型AIV陽性血清進行檢測。用類病毒脂質(zhì)體、HA蛋白和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原的方法，陽性檢出率均為100%，而以VLP為抗原的方法陽性檢出率為98%。

2.9 血凝抑制試驗

分別采用VLP、類病毒脂質(zhì)體和滅活的H5N1亞型AIV抗原對30份陽性血清及1份SPF雞陰性血清進行HI抗體滴度檢測，結(jié)果同一血清樣品用類病毒脂質(zhì)體作為抗原和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原測定的抗體效價相差不超過1個滴度，同一血清樣品用VLP作為抗原和用滅活的H5N1亞型AIV作為抗原測定的抗體效價相差不超過2個滴度。總體而言，類脂質(zhì)體與VLP相比較，具有更好的抗原性，更接近于滅活的H5N1亞型AIV，結(jié)果如表6。

表6 雞血清中HI滴度檢測結(jié)果Table 6 The detection results of HI titer in chicken sera

3 討論

通過一系列驗證性試驗，結(jié)果表明制備的3種物質(zhì)中類病毒脂質(zhì)體與滅活全病毒一樣，具有較好的免疫原性，但比滅活全病毒更安全，因此在抗體檢測方面具有更好的應用前景。

目前，針對VLP的研究主要集中在疫苗的開發(fā)，有些VLP疫苗已經(jīng)成功應用于臨床，如人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）四價VLP疫苗已經(jīng)獲得批準并投放到市場［7］；乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的 VLP預防性疫苗也研制成功并獲準投放到市場中［8］。除此以外，雞傳染性囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、引起重癥急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome，SARS）的冠狀病毒等VLP的疫苗都有較為深入的研究與開發(fā)［9］。同時，國內(nèi)外學者針對禽流感也建立了一系列檢測方法，包括血凝抑制試驗、ELISA、RT-PCR、熒光RT-PCR、環(huán)介導等溫擴增技術等［10-11］，但針對禽流感病毒抗體的檢測均采用的是滅活的AIV作為檢測抗原。

本研究分別制備了AIV VLP、類病毒脂質(zhì)體和HA蛋白，尤其是VLP和類病毒脂質(zhì)體均不含有病毒核酸，在形態(tài)上與真實的病毒相似，從而希望利用其特點在疫苗領域及檢測領域充分發(fā)揮其抗原抗體免疫反應的作用［12-13］。通過采用上述3種抗原物質(zhì)分別包被酶標板，建立了相應的H5N1亞型AIV抗體ELISA檢測方法。特異性試驗、敏感性試驗、重復性試驗和穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，類病毒脂質(zhì)體相對于VLP和HA蛋白而言，在檢測方面具有更為良好的表現(xiàn)，而VLP在特異性反應中所表現(xiàn)的結(jié)果并不理想，原因可能是因為M1蛋白較為保守，干擾了對流感病毒不同亞型的區(qū)別，類病毒脂質(zhì)體由于只有HA蛋白的存在，因此能較好的體現(xiàn)其型特異性。此外，類病毒脂質(zhì)體由于在形態(tài)上類似于真實的病毒，故在敏感性方面優(yōu)于用傳統(tǒng)方法處理的單獨表達的HA蛋白。綜上所述，本研究以類病毒脂質(zhì)體為基礎，成功地建立了一種檢測H5N1亞型AIV的ELISA方法，提示類病毒脂質(zhì)體在免疫檢測領域內(nèi)具有良好的應用前景，尤其是在重大人畜共患病免疫檢測方法研究中具有安全優(yōu)勢。

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