侯偉杰，高 洋，高晶暉，安 貝，張淼濤，陳德坤

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

乳房炎是奶山羊養(yǎng)殖業(yè)中流行面廣、造成損失最大的疾病之一。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前我國奶山羊隱性乳房炎的檢出率約為43%左右［1］，其不僅會降低乳產(chǎn)量，還會嚴(yán)重影響乳品質(zhì)［2］。相對于奶牛乳房炎病原菌的復(fù)雜性，奶山羊乳房炎的病原菌主要為大腸埃希菌（占18%）、金黃色葡萄球菌（占15%）、表皮葡萄球菌（占26%）及產(chǎn)色葡萄球菌（占20%）［3］，因此可利用此4種細(xì)菌制備疫苗進行奶山羊乳房炎的防控。大量研究顯示，免疫佐劑是疫苗的關(guān)鍵組成部分，通過合理有效安全的使用佐劑，可以增強抗原的免疫原性，增強宿主對抗原的保護性應(yīng)答。常用的免疫佐劑主要包括鋁膠鹽、蜂膠、轉(zhuǎn)移因子等，這些佐劑可通過參與抗原遞呈、免疫調(diào)節(jié)等方式促進免疫應(yīng)答。本研究以奶山羊乳房炎的主要病原菌為材料制備了乳房炎滅活苗，并探討了鋁膠鹽、蜂膠和轉(zhuǎn)移因子佐劑的促進免疫應(yīng)答作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 陜西富平縣第一養(yǎng)殖小區(qū)的處于泌乳期的薩能奶山羊。

1.1.2 菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性產(chǎn)色葡萄球菌、凝固酶陰性表皮葡萄球菌，均為西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室分離鑒定保存的奶山羊乳房炎病原菌。

1.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)移因子為西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室制備、保存的豬脾臟轉(zhuǎn)移因子；蜂膠；LB液體培養(yǎng)基；辣根過氧化物酶標(biāo)二抗（兔抗羊IgG－HRP）；可溶性單組分TMB 底物溶液及蛋白定量試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；奶山羊隱性乳房炎診斷液由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)免疫學(xué)實驗室制備（配方獲發(fā)明專利，授權(quán)號：ZL 200910024340.7）；氯化鈉；硫酸鋁鉀；氫氧化鈉；無水乙醇；吐溫－80等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌懸液制備 將菌株分別接種LB 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12h～16h后用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，分別調(diào)整細(xì)菌濃度為產(chǎn)色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為5×109CFU／mL，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌終濃度為2.5×109CFU／mL。

1.2.2 細(xì)菌滅活 向調(diào)整好濃度的菌液中加入終濃度為3mL／L 的甲醛溶液，大腸埃希菌振蕩滅活48h，葡萄球菌振蕩滅活96h后，取適量菌液涂LB平板，37 ℃培養(yǎng)24h，觀察平板有無菌落形成。

將滅活好的菌液12 000r／min離心5min，棄上清、收集菌體沉淀。

1.2.3 疫苗的制備 將滅活的產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌按照其在隱性乳房炎乳汁中的比例混合，得到混合菌泥。

鋁膠鹽佐劑疫苗的制備：菌泥與實驗室制備的鋁膠鹽佐劑按6∶1（V／V）充分混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗的制備：混合菌泥用適量轉(zhuǎn)移因子重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蜂膠佐劑疫苗的制備：取適量蜂膠溶解于950mL／L的酒精，使蜂膠濃度為1 000 mg／mL，然后取此濃度蜂膠與吐溫80按體積比1∶4混勻，最后用混合液重懸菌泥。蜂膠終濃度為20 mg／mL，吐溫80終濃度為10%。

3種佐劑疫苗中，產(chǎn)色葡萄球菌和表皮葡萄球菌濃度為5×109CFU／mL，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌終濃度為2.5×109CFU／mL。

1.2.4 免疫試驗 免疫前，用隱性乳房炎快速診斷試劑對泌乳期的112只奶山羊進行普查。根據(jù)普查結(jié)果，將奶山羊進行如下分組：10 只乳房炎陰性奶山羊作為對照組，試驗中不作任何處理。另外102只奶山羊分成3組：鋁膠鹽組35只，轉(zhuǎn)移因子組33只，蜂膠組34 只。免疫接種時，3 個組的免疫劑量均為2mL／只，免疫部位為頸部皮下免疫。第一次免疫接種后14d，以同樣劑量和部位再進行免疫接種。

1.2.5 樣本采集 在免疫前及第一次免疫和第二次免疫后的第10天采集所有羊的乳汁和血液樣本。分離乳清和血清，保存于－20 ℃用于后續(xù)測定。

1.2.6 抗體效價測定 用間接ELISA 方法［4］測定乳汁和血液樣本中各菌病原菌抗體效價。P／N≥2.1判為陽性，否則判定為陰性。

1.2.7 隱性乳房炎檢測 分別在免疫前、一免后10d，二免后10d用奶山羊隱性乳房炎診斷液對各免疫組和對照組奶山羊進行檢測，并統(tǒng)計檢出率。采用Graphpad5 軟件進行數(shù)據(jù)檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌滅活效果

大腸埃希菌滅活48h，葡萄球菌滅活96h后，取100μL 菌液涂LB 平板，37 ℃，培養(yǎng)24h后，觀察，平板上無菌落形成，表明細(xì)菌滅活徹底。

2.2 乳中各病原抗體測定結(jié)果

同對照組相比，蜂膠組在一免和二免后，表皮葡萄球菌抗體效價均顯著升高（P＜0.05），大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價均升高，但與對照組相比無顯著性差異；轉(zhuǎn)移因子組中，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抗體效價在兩次免疫后均顯著高于對照組（P＜0.05），產(chǎn)色葡萄球菌抗體在第二次免疫后顯著高于對照組（P＜0.05）；鋁膠鹽組同對照組相比，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價在一免后均顯著增加（P＜0.05），二免后，增加更顯（P＜0.01）（圖1～圖4）。

圖1 不同免疫佐劑大腸埃希菌乳清抗體效價Fig.1 E.coli antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

圖2 不同免疫佐劑金黃色葡萄球菌乳清抗體效價Fig.2 S.aureus antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

圖3 不同免疫佐劑表皮葡萄球菌乳清抗體效價Fig.3 S.epidermidis antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

圖4 不同免疫佐劑產(chǎn)色葡萄球菌乳清抗體效價Fig.4 S.chromolgenes antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

2.3 各組血中細(xì)菌抗體的測定結(jié)果

二次免疫后，同對照組相比，蜂膠組中各菌的抗體效價均增加，但無顯著性差異；轉(zhuǎn)移因子組中大腸埃希菌和產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價在第一次免疫后就顯著高于對照組（P＜0.05），金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抗體效價則在第二次免疫后顯著增加（P＜0.05）；鋁膠鹽組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和產(chǎn)色葡萄球菌抗體效價在第一次和第二次免疫后均顯著高于對照組（P＜0.05）（圖5～圖8）。

圖5 不同免疫佐劑大腸埃希菌血清抗體效價Fig.5 E.coli antibody titers of different adjuvant groups in serum

圖6 不同免疫佐劑金黃色葡萄球菌血清抗體效價Fig.6 S.aureus antibody titers of different adjuvant groups in serum

圖7 不同免疫佐劑表皮葡萄球菌血清抗體效價Fig.7 S.epidermidis antibody titers of different adjuvant groups in serum

圖8 不同免疫佐劑產(chǎn)色葡萄球菌血清抗體效價Fig.8 S.chromolgenes antibody titers of different adjuvant groups in serum

2.4 隱性乳房炎檢出結(jié)果

在整個試驗過程中，對照組的奶山羊隱性羊乳房炎均未檢出。在第一次免疫后，蜂膠組隱性乳房炎檢出率在整個試驗過程中基本無變化，保持在65%左右；轉(zhuǎn)移因子組的隱性乳房炎檢出率在第一次免疫后，由免疫前的62.8%下降至54.8%，在第二次免疫后檢出率為55.2%，基本與第一次免疫后持平；鋁膠鹽組隱性乳房炎檢出率在首次免疫后下降趨勢明顯，由免疫前60%迅速下降為34.5%，第二次免疫后又下降至30%。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗和鋁膠鹽佐劑疫苗對隱性乳房炎均有治療作用，其中鋁膠鹽佐劑疫苗的治療作用更顯著（圖9）。

圖9 不同免疫佐劑組隱性乳房炎檢出率統(tǒng)計Fig.9 Detection rate of subclinical mastitis in different adjuvant groups

3 討論

奶山羊乳房炎的主要病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌及產(chǎn)色葡萄球菌［3］，均為細(xì)胞外寄生菌。大量的研究表明，體液免疫應(yīng)答在清除胞外菌感染中具有重要意義。滅活疫苗對胞外寄生菌具有較好的免疫效果，其激發(fā)的體液免疫應(yīng)答中產(chǎn)生的抗體，在乳腺抵抗病原菌的感染中具有重要的作用，包括對細(xì)菌繁殖的抑制作用，對細(xì)菌的溶解作用及調(diào)理吞噬作用等，乳腺組織內(nèi)抗體濃度及活性的變化可直接影響疾病的發(fā)生。因此，本研究以此4種菌為材料制備了滅活疫苗。

鋁膠鹽是目前在人類及動物上唯一被批準(zhǔn)使用的無機物類佐劑，可通過對抗原的吸附作用增強機體免疫應(yīng)答［5］，其中主要是誘導(dǎo)機體的體液免疫應(yīng)答，研究顯示，鋁膠鹽佐劑能通過誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的活化來促進IL－18、IL－33和PGE2的釋放，釋放的這些細(xì)胞因子會促進TH2 型細(xì)胞因子（比如IL－4、IL－5和IL－13）的產(chǎn)生，從而促進TH2 型免疫應(yīng)答［6］，另外鋁膠鹽還能通過顯著增加機體的免疫球蛋白IgE（小鼠和人）［7－8］來促進免疫應(yīng)答；目前蜂膠中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)超過300種，其中的很多生物活性物質(zhì)都具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，包括促進T 細(xì)胞增殖及增強T 細(xì)胞活性等，增強機體免疫功能［9］，推測蜂膠的佐劑作用很可能是通過蜂膠中各成分的協(xié)同作用而發(fā)揮的［10］；轉(zhuǎn)移因子能刺激機體產(chǎn)生高水平的IFN－γ，增強細(xì)胞免疫應(yīng)答［11］，并且無任何毒副作用，研究顯示牦牛脾臟轉(zhuǎn)移因子對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有促進作用［12］。本研究選用處于泌乳期的奶山羊作為研究對象，通過不同免疫佐劑的奶山羊乳房炎滅活苗免疫試驗，探討了鋁膠鹽佐劑、蜂膠佐劑和轉(zhuǎn)移因子佐劑的免疫促進作用。結(jié)果顯示，本研究中所制備的蜂膠佐劑疫苗的免疫效力較低，刺激機體產(chǎn)生的抗體水平與對照組相比無顯著性差異，隱性乳房炎檢出率也無明顯變化；轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗具有一定的免疫效力，同對照組相比，各病原菌抗體效價在第2次免疫后有顯著增加（P＜0.05），隱性乳房炎檢出率在免疫后稍有下降，說明轉(zhuǎn)移因子佐劑疫苗對患隱性乳房炎的奶山羊具有一定的治療作用；膠鹽佐劑疫苗免疫效力最強，免疫鋁膠鹽佐劑疫苗的奶山羊，機體針對各病原菌的抗體效價在首免和二次免疫后均顯著增加（P＜0.05），隱性乳房炎檢出率顯著降低。研究表明同蜂膠和轉(zhuǎn)移因子相比，鋁膠鹽佐劑能刺激機體產(chǎn)生更強的體液免疫應(yīng)答，對隱性乳房炎的治療效果更顯著。

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