何丹，楊林，秦少容，張景勍

超高效液相色譜法測(cè)定半夏不同炮制品中核苷類成分含量*

何丹1，楊林2，秦少容3，張景勍1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶 401331；3.太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000)

目的 建立以超高效液相色譜(UPLC)法測(cè)定不同炮制工藝半夏中尿苷、鳥苷和腺苷含量的方法。 方法 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為水-甲醇，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速0.5 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。 結(jié)果 尿苷在2.214～22.140 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=93 991X-1 653(r=0.999 9)，平均回收率為99.18%，RSD=2.40%；鳥苷在1.212～12.120 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=61 542X-806(r=0.999 9)，平均回收率為98.88%，RSD=1.16%；腺苷在0.245 2～2.452 0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=14 994X-145(r=0.999 9)；平均回收率為98.66%，RSD=0.97%。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、快速，能有效地測(cè)定不同炮制工藝半夏中尿苷、鳥苷和腺苷的含量。

半夏；炮制工藝；核苷；色譜法，超高效液相

半夏為天南星科植物半夏[Pineliaternate(thumb.)Breit.]的干燥塊莖，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味辛，有小毒，歸脾、胃、肺經(jīng)。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效[1]。半夏含有有機(jī)酸類、核苷類、生物堿類等化學(xué)成分[2]。生半夏有一定的毒性，內(nèi)服需炮制后使用。根據(jù)不同的炮制工藝，炮制品又分為姜半夏、清半夏和法半夏等多種?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010年版規(guī)定半夏及清半夏藥材的質(zhì)量控制均采用電位滴定法測(cè)定其總有機(jī)酸的含量[1]，以琥珀酸量計(jì)算。目前關(guān)于半夏含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道有生物堿類成分[3]、有機(jī)酸[4]、氨基酸[5]、核苷[6]和多糖[7]成分的測(cè)定。其中核苷類成分是半夏藥材中較為重要有效成分，含量較高的有尿苷、鳥苷和腺苷[8]。而報(bào)道的對(duì)半夏藥材及飲片中核苷類成分的測(cè)定多采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)法和毛細(xì)管電泳法。HPLC法測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，毛細(xì)管電泳法用內(nèi)標(biāo)法，操作繁瑣[9-11]。筆者目前未見(jiàn)采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)法對(duì)不同炮制工藝半夏藥材中核苷類成分進(jìn)行測(cè)定比較的報(bào)道，故采用UPLC法進(jìn)行了相關(guān)研究。該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性和精密度良好，能夠?yàn)榘胂募安煌谥破返馁|(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC(美國(guó)Waters公司)；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱(美國(guó)Waters 公司)；AG 135型電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)。

1.2 試藥 半夏藥材(甘肅天水，經(jīng)重慶太極集團(tuán)質(zhì)檢部楊修齊研究員鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata的干燥塊莖)；尿苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110887-200202)；鳥苷對(duì)照品(上海同田生物有限公司，含量：98%，批號(hào)：12111835)；腺苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110879-200202)。甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)默克公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為水-甲醇，按表1梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量5 μL，理論板數(shù)按尿苷峰計(jì)算不低于4 000。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 ①精密稱取尿苷對(duì)照品22.14 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為221.4 μg·mL-1尿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。②精密稱取鳥苷對(duì)照品12.12 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為121.2 μg·mL-1鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。③精密稱取腺苷對(duì)照品24.52 mg，置100 mL量瓶中，加少量甲醇溶解，再加水稀釋至刻度，搖勻，得腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為24.52 μg·mL-1腺苷對(duì)照品溶液。④精密吸取尿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液、鳥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液和腺苷對(duì)照品溶液各5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 姜半夏：取半夏1 kg，加入飲用水浸泡72 h，8 h換水一次；加入生姜共煎，生姜用量為25%；加入8倍量水，分別90 ℃溫浸2次，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取1 mL濃縮液，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液即為姜半夏供試品溶液。

清半夏：取凈半夏1.5 kg，用8%白礬水溶液浸泡，至內(nèi)無(wú)干心，口嘗微有麻舌感，取出，洗凈，干燥。篩去碎屑。取清半夏1 kg，加入8倍量水，溫浸2次(90 ℃)，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取濃縮液1 mL，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液，即得清半夏供試品溶液。

法半夏：取凈半夏1.5 kg，大小分開(kāi)，用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心。取甘草225 g，加水煎煮2次，合并煎液，倒入用生石灰150 g制成的石灰液中，攪勻，加入上述已浸透的半夏，浸泡，每日攪拌1或2次，并保持浸泡液pH>12，至剖面黃色均勻，口嘗微有麻舌感時(shí)，取出，洗凈，陰干或烘干，即得。取法半夏1 kg，加入8倍量水，分別90 ℃溫浸2次，第1次3 h，第2次2 h，合并減壓濃縮至510 mL。取濃縮液1 mL，加水稀釋至25 mL，經(jīng)內(nèi)徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液即為法半夏供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸。尿苷的回歸方程為：Y=93 991X-1 653(r=0.999 9)；鳥苷的回歸方程為：Y=61 542X-806(r=0.999 9)；腺苷的回歸方程為：Y=14 994X-145(r=0.999 9)。結(jié)果表明，尿苷濃度在2.214～22.140 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；鳥苷濃度在1.212～12.120 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；腺苷濃度在0.245 2～2.452 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 按樣品溶液制備色譜條件制備清半夏樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.55%，1.28%和1.36%，符合精密度實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按樣品溶液制備方法制備清半夏樣品溶液，室溫下放置0，1，2，4，6，8 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5 μL測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積基本不變，尿苷、鳥苷和腺苷的RSD分別為0.65%，0.71%和0.88%，表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按樣品溶液制備方法平行配制清半夏樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，尿苷、鳥苷和腺苷的平均含量分別為55.3，43.0和2.17 μg·g-1，RSD分別為0.88%，1.01%和0.93%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)知含量的清半夏提取物，分別精密量取5 mL，共27份，置10 mL量瓶中，分別精密加入提取物中尿苷、鳥苷和腺苷含量約80%，100%和120%的對(duì)照品儲(chǔ)備液，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果尿苷、鳥苷和腺苷的平均回收率分別為99.18%，98.88%和98.66%，RSD分別為2.40%，1.16%和0.97% 。

2.9 不同炮制工藝半夏藥材含量測(cè)定 取不同炮制工藝半夏供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以峰面積代入線性方程計(jì)算，3種半夏中尿苷、鳥苷和腺苷的含量結(jié)果見(jiàn)表2，色譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

半夏因其味辛辣、麻舌而刺喉，具有“戟人咽”的刺激性，被列為有毒中藥。因此應(yīng)用時(shí)一般要有去毒的炮制過(guò)程。采用各種不同的炮制方法，既能降低半夏的毒性，又能擴(kuò)大半夏的應(yīng)用范圍。臨床使用多以炮制品入藥，主要有清半夏、姜半夏、法半夏?，F(xiàn)代研究認(rèn)為半夏毒性主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈的刺激性，主要由草酸鈣針晶引起，由于草酸不溶于水和各種有機(jī)溶劑，但能夠溶于酸、堿性溶液，而炮制輔料白礬和石灰水則分別呈一定的酸、堿性，因此炮制后草酸鈣針晶被不同程度破壞，降低半夏的毒性，使其刺激性降低或消失[12]。

表2 不同炮制工藝半夏核苷含量測(cè)定

A.混合對(duì)照品溶液；B.清半夏；C.法半夏；D.姜半夏；1.尿苷；2.鳥苷；3.腺苷

A.mix standards solution；B.clearPinelliaternate；C.rhizomaPinelliaepraeparatum；D.gingerPinelliaternate；1.uridine；2.guanosine；3.adenosine

Fig.1 UPLC chromatogram of nucleosides inPinelliaternatawith different processing

半夏及清半夏的質(zhì)量控制方法，《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版中采取電位滴定法對(duì)醇提取物中有機(jī)酸總量(以琥珀酸含量計(jì)算)進(jìn)行含量測(cè)定，姜半夏和法半夏還沒(méi)有規(guī)定含量測(cè)定項(xiàng)目[1]。半夏及清半夏藥材質(zhì)量控制指標(biāo)是有機(jī)酸類化合物總量，沒(méi)有具體的指標(biāo)成分，且滴定法相對(duì)干擾因素較多。對(duì)半夏藥材及其炮制品中水提取物的質(zhì)量控制沒(méi)有明確規(guī)定，但核苷的藥理活性明確，在半夏藥材中含量也較高，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，清半夏中3種核苷的總含量高達(dá)100 μg以上，同時(shí)不同的半夏炮制品核苷成分含量差異也較大。因此建立核苷類成分的測(cè)定方法對(duì)于半夏及炮制品的質(zhì)量控制具有重要參考意義。

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Determination of the Content of Nucleosides in Differently ProcessedPinelliaternataby UPLC

HE Dan1, YANG Lin2, QIN Shaorong3, ZHANG Jingqing1

(1.CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofPharmacy,ChongqingMedicalandPharmaceuticalCollege,Chongqing401331,China; 3.TaijiChongqingFulingPharmaceuticalGroupCo.LTD,Chongqing, 408000,China)

Objective To establish an ultra-performance liquid chromatography (UPLC) method for detecting content of uridine, guanosine and adenosine inPinelliaternata. Methods Acquity UPLC Ben C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) was used.The mobile phase was methanol and water by gradient elution mode, and the column temperature was 30 ℃.The flow rate was 0.5 mL·min-1and the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range of uridine was 2.214-22.14 μg·mL-1.The regression equation wasY=93 991X-1 653 (r=0.999 9).The linear range of guanosine was 1.212-12.12 μg·mL-1, and the regression equation wasY=61 542X-806 (r=0.999 9).The linear range of adenosine was 0.245 2-2.452 0 μg·mL-1, and the regression equation wasY=14 994X-145 (r=0.999 9).The average recovery was 99.18% (RSD=2.40%), 98.88% (RSD=1.16%) and 98.66% (RSD=0.97%) for uridine, guanosine and adenosine, respectively. Conclusion The method is rapid, reliable and can be used to determine nucleosides inPinelliaternate.

Pinelliaternate; Processing; Nucleosides; Chromatography, ultra-performance liquid

2014-01-10

2014-03-20

*國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI13B03)

何丹(1977-)，女，四川達(dá)州人，副教授，在讀博士 ，主要從事中藥分析研究。電話：(0)15310985850，E-mail：ildoctor@163.com。

張景勍(1973-)，女，重慶人，研究員，博士 ，主要從事藥物制劑研究。電話：(0)13308300303，E-mail：zjqrae01@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)02-0231-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.025