鄒文燾 劉廣鵬

β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）是目前較為常用的骨組織工程支架材料，具有良好的生物相容性[1]和可降解性，構(gòu)建的組織工程骨有望成為臨床修復(fù)骨缺損的新方法[2-3]。組織工程骨的體外構(gòu)建過(guò)程中常應(yīng)用胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）作為細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，而β-TCP的多孔支架結(jié)構(gòu)易于吸附異種蛋白成分，因而會(huì)對(duì)組織工程骨臨床應(yīng)用的生物安全性造成影響。本文擬從β-TCP構(gòu)建的組織工程骨牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）殘余量的角度進(jìn)行研究，為評(píng)價(jià)組織工程骨生物安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸三鈣 （β-TCP）（上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心研制）；牛血清白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（無(wú)錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM 低糖培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素C（Sigma公司，美國(guó)）。

Beckman XL90低溫離心機(jī) （Beckman公司，德國(guó)）；TC-100B恒溫水平搖床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs分離培養(yǎng)

按文獻(xiàn)[4-5]的方法，從正常人骨髓中分離純化BMSCs，按1×106cells/cm2有核細(xì)胞的密度接種培養(yǎng)皿，加入含有10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后隔日換液。原代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增至第2代細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 組織工程骨的體外構(gòu)建

以 β-TCP 為支架材料（4 mm×4 mm×4 mm），環(huán)氧乙烷消毒后置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。取第2代hBMSCs，以1×106cells/mL的密度接種于β-TCP。每塊材料接種10 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量為1×104個(gè)。將細(xì)胞材料復(fù)合物置于細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h后，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含低糖DMEM，10%FBS，10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油鈉和 10-4mol/L維生素C），37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，于檢測(cè)前1 d更換為無(wú)血清的條件培養(yǎng)液，制備成待檢測(cè)的組織工程骨樣品。對(duì)照組為未接種細(xì)胞的β-TCP，同樣置于200 μL成骨條件培養(yǎng)液中2周，檢測(cè)前1 d更換為無(wú)血清的條件培養(yǎng)液。

1.2.3 酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定BSA含量

應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中BSA含量。首先用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體。包被單抗的微孔中加入BSA抗原，經(jīng)過(guò)結(jié)合、洗滌后加入酶標(biāo)抗BSA抗體，洗滌后用顯色劑顯色。顏色的深淺和樣品中的BSA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品BSA濃度。

1.2.4 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1.2.4.1 細(xì)胞洗滌液的準(zhǔn)備

第2代hBMSCs長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部后常規(guī)消化，1 500 r/min離心5 min，棄去液體，細(xì)胞計(jì)數(shù)。添加10 mL PBS，重懸細(xì)胞，離心，收集PBS液體。再重復(fù)2次，獲得3次細(xì)胞洗滌液待測(cè)。

1.2.4.2 組織工程骨樣品的準(zhǔn)備

取組織工程骨樣品，以體積比1∶100的37℃生理鹽水浸泡并洗滌3次，每次10 min，然后將樣品置于濾紙上吸附殘余液體，剪碎，稱重，置于1.5 mL的Eppendorf管中。根據(jù) 《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于試驗(yàn)材料浸提液的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[6]，每0.2 g樣品加1 mL PBS平放固定于搖床，37℃、150 r/min振蕩浸提24 h。對(duì)照組樣品同法處理獲取浸提液。每例樣品吸取0.3 mL浸提液待測(cè)。另將組織工程骨樣品3次浸泡沖洗后的生理鹽水也分別取樣待測(cè)。

1.2.5 BSA殘余量測(cè)定

96孔酶標(biāo)板（試劑盒自備）分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔（復(fù)孔數(shù)均為2）。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品50 μL。輕輕混勻，37℃密封溫育60 min。將酶標(biāo)板取出棄去液體，甩干，每個(gè)孔中加洗滌液300~350 μL，反應(yīng)30 sec后甩去液體，在濾紙上將酶標(biāo)板拍干。重復(fù)此步驟3次。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入100 μL的酶標(biāo)多抗溶液，20℃~25℃避光孵育30 min。洗板4次，拍干。依序每孔加底物溶液50 μL，20℃~25℃避光顯色 10~15 min。 依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。10 min內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，算出樣品實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件，通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)組織工程骨和單純?chǔ)?TCP材料的BSA殘余量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以s表示，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs的分離、純化、培養(yǎng)和傳代

待測(cè)細(xì)胞為正常人第2代BMSCs（圖1），長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部時(shí)的細(xì)胞數(shù)量約為1.5~2×106個(gè)。

2.2 組織工程骨的體外構(gòu)建

顯微CT和掃描電鏡觀察可見(jiàn)β-TCP呈相互貫通的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑為300~500 μm，孔隙率為（92.6±1.1）%。hBMSCs接種 β-TCP 后，體外繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，掃描電鏡檢測(cè)顯示材料表面可見(jiàn)細(xì)胞分泌較多細(xì)胞外基質(zhì)（圖2）。

2.3 細(xì)胞洗滌液中BSA濃度

BSA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)范圍為0~40 ng/mL，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9832，符合試劑盒規(guī)定的R2>0.97的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求。

細(xì)胞洗滌液 BSA 濃度為（712.49±111.40）ng/mL、（38.69±26.20）ng/mL 和 （2.32±1.78）ng/mL，3 次結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=3，圖 3）。

2.4 組織工程骨洗滌液BSA濃度

組織工程骨洗滌液中BSA含量，隨洗滌次數(shù)增多而明顯降低。3次洗滌液的BSA濃度分別為（305.86±93.41）ng/mL、（39.19±8.26）ng/mL 和（6.43±1.57）ng/mL，3 次結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，n=10，圖 4）。

2.5 組織工程骨BSA殘余量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組平均干重為（26.02±5.07）mg，對(duì)照組為（21.59±6.69）mg，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，n=10，圖5）。實(shí)驗(yàn)組平均BSA殘余量為 （19.54±6.70）ng，單位重量的 BSA 殘余量為（0.656±0.213）ng/mg。 對(duì)照組的相應(yīng)值分別為 （15.67±5.49）ng和（0.796±0.205）ng/mg， 兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05，n=10，圖 6）。

圖1 BMSCs形態(tài)觀察Fig.1 Histological observation of BMSCs

圖2 β-TCP支架材料大體觀及鏡下觀Fig.2 General observation and microscopic observation of β-TCP scaffold material

圖3 細(xì)胞洗滌液BSA含量Fig.3 BSA content of in the dilution liquid of BMSCs

圖4 組織工程骨洗滌液BSA含量Fig.4 BSA content of in the dilution liquid of tissue engineered bone

圖5 每塊樣品BSA殘余量Fig.5 The average residual BSA in tissue engineered bone

圖6 單位重量樣品BSA殘余量Fig.6 The normalized residual BSA in tissue engineered bone

3 討論

組織工程骨在構(gòu)建過(guò)程中，其種子細(xì)胞的培養(yǎng)多需添加胎牛血清（FBS）；在細(xì)胞與支架材料的復(fù)合過(guò)程中，也需要FBS作為介質(zhì)，提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)，維持細(xì)胞活性。生物支架材料的三維多孔性結(jié)構(gòu)使材料內(nèi)表面積增大，有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，為細(xì)胞基質(zhì)分泌與合成提供良好的外環(huán)境，又便于營(yíng)養(yǎng)成分的運(yùn)輸及代謝產(chǎn)物的排出[7-8]。但同時(shí)也容易吸附培養(yǎng)液中的BSA等異種蛋白。BSA作為牛血清中含量最高的蛋白質(zhì)成分，能夠?qū)е聶C(jī)體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。因此，BSA殘余量的多少關(guān)系到組織工程產(chǎn)品的安全性。

《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版三部）規(guī)定，人體疫苗的BSA殘余量按酶聯(lián)免疫方法進(jìn)行檢測(cè)，每件不超過(guò)50 ng[9]。目前，組織工程骨的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，相關(guān)的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ELISA法檢測(cè)常規(guī)消化后的細(xì)胞洗滌液中的BSA含量。結(jié)果表明，BMSCs洗滌液中BSA濃度隨著洗滌次數(shù)的增加而明顯降低；經(jīng)過(guò)3次洗滌后，細(xì)胞洗滌液中的BSA殘余量能夠降至藥典規(guī)定的BSA殘余量上限。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，以β-TCP為支架的組織工程骨樣品的BSA殘余量平均值為19.54 ng。若修復(fù)骨缺損的材料體積為2 cm3，其規(guī)格大小對(duì)于臨床應(yīng)用而言并不是很大，但相應(yīng)的BSA殘余量將達(dá)到610.62 ng，這將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出藥典的規(guī)定限量。而接種BMSCs的組織工程骨與未接種細(xì)胞的β-TCP材料相比，兩者單位重量的BSA殘余量無(wú)顯著性差異，表明支架材料較種子細(xì)胞更為容易吸附殘留BSA。

本實(shí)驗(yàn)表明，在種子細(xì)胞體外培養(yǎng)階段，所使用的血清成分易于通過(guò)離心洗滌的方法予以去除；而當(dāng)細(xì)胞與支架材料進(jìn)行復(fù)合之后，由于支架材料會(huì)大量吸附培養(yǎng)基中的血清成分，此時(shí)難以再將血清從支架中分離出來(lái)。理想的清洗流程應(yīng)在綜合考慮最大限度清除殘留BSA，并最大限度保留產(chǎn)品生物學(xué)活性之間取得平衡，以兼顧產(chǎn)品的安全性和有效性，這方面的研究目前尚未引起足夠重視[10]。

[1]Wiedmann-Al-Ahmad M,Gutwald R,Gellrich NC,et al.Growth of human osteoblast-like cells on beta-tricalciumphosphate(TCP)membranes with different structures[J].J Mater Sci Mater Med,2007,18(4):551-563.

[2]Szpalski C,Wetterau M,Barr J,et al.Bone tissue engineering:current strategies and techniques--part I:Scaffolds[J].Tissue Eng Part B Rev,2012,18(4):246-257.

[3]Panseri S,Russo A,Cunha C,et al.Osteochondral tissue engineering approaches for articular cartilage and subchondral bone regeneration[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2012,20(6):1182-1191.

[4]劉廣鵬,趙莉,劉波,等.新型β-磷酸三鈣的制備與成骨能力的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2006,8(8):755-759.

[5]劉廣鵬,趙莉,袁捷,等.多孔β-磷酸三鈣陶瓷表面處理前后的成骨能力比較[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志,2006,4(3):202-206.

[6]國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 16886.12-2000醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)—第12部分:樣品的制備與參照樣品[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2000.

[7]Gurin AN,Komlev VS,Fadeeva IV,et al.A comparative study of bone regeneration potency of alfa and beta-tricalcium phosphate bone substitute materials[J].Stomatologiia,2012,91(6):16-21.

[8]Fong EL,Watson BM,Kasper FK,et al.Building bridges:leveraging interdisciplinary collaborations in the development of biomaterials to meet clinical needs[J].Adv Mater,2012,24(36):4995-5013.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[10]方玉,馮曉明,奚廷斐.組織工程醫(yī)療產(chǎn)品中殘留牛血清白蛋白的檢驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(32):6347-6350.