林 靜，酉鵬華，程 功，王 毅，陳海潮，楊 征，郭 敏

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病［1］。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一類具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群。研究證實(shí)，Treg具有抗AS作用。AS患者循環(huán)與AS模型動物Treg數(shù)量顯著減少，功能明顯受損［2］；體內(nèi)誘導(dǎo)和過繼轉(zhuǎn)輸Treg均可明顯抑制apoE－／－小鼠動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生［3，4］。進(jìn)一步研究證實(shí)Treg抗AS的機(jī)制與其內(nèi)皮保護(hù)及抗巨噬細(xì)胞泡沫化有關(guān)［5，6］，但是Treg是否對AS斑塊細(xì)胞死亡有影響目前尚無研究。本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對象，觀察Treg對小鼠巨噬細(xì)胞死亡的影響，并對其可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57B小鼠，SPF級，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄不限，8周～12周齡。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液購自上海試劑二廠。小鼠CD4＋CD25＋T細(xì)胞磁珠分離試劑盒，MiDiMACS、分選器，LD和MS分選柱購自德國Miltenyi Biotec公司；抗小鼠CD3單克隆抗體為BD Pharmingen公司產(chǎn)品；RPMI1640及胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。Cyto－Tox 96細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Promega公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。Calcein／EthDⅢ染色試劑盒購自Biotium公司。小鼠白細(xì)胞介素 （IL）－18、IL－β1ELISA 試 劑 盒 購 自 eBiosience 公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.3.1.1 CD4＋CD25＋T細(xì)胞及CD4＋CD25－T細(xì)胞的分離 斷頸處死小鼠，取脾臟，F(xiàn)icoll分離獲得單個核細(xì)胞；通過小鼠CD4＋T細(xì)胞磁珠分離試劑盒，陰性選擇獲得CD4＋T細(xì)胞；加入PE標(biāo)記抗小鼠CD25單克隆抗體，再加入磁珠標(biāo)記抗PE，陽性選擇獲得CD4＋CD25＋T細(xì)胞，陰性選擇獲得CD4＋CD25－T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur）分析細(xì)胞純度。

1.3.1.2 巨噬細(xì)胞的分離 斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡10 min，剖腹收集腹腔內(nèi)液，800 r／min離心5 min后收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106／mL，加入培養(yǎng)板中，置5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)4 h后去上清液，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 CD4＋CD25＋T細(xì)胞、CD4＋CD25－T細(xì)胞（均為5×1 05細(xì)胞／孔）與抗小鼠CD3 mAb（5 0 ng／mL）孵育40 h后，分別加入已有貼壁巨噬細(xì)胞（3×106／孔～4×106／孔）的培養(yǎng)板，在終濃度均為50 mg／L的氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）共培養(yǎng)48 h，分為4組。對照組：巨噬細(xì)胞＋PBS；ox－LDL組：巨噬細(xì)胞＋100 mg／L ox－LDL；CD25＋T細(xì)胞組（CD25＋組）：巨噬細(xì)胞＋CD4＋CD25＋T 細(xì) 胞 ＋100 mg／L ox－LDL；CD4＋CD25－T細(xì)胞組（CD25－組）：巨噬細(xì)胞＋CD4＋CD25－T細(xì)胞＋100 mg／L ox－LDL。各組細(xì)胞均置5%CO2、37℃孵箱，培養(yǎng)24 h后收獲。

1.3.3 LDH流出檢測 上述各組細(xì)胞培養(yǎng)后，收集上清，按照CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，于490 nm記錄吸光值并測定乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.3.4 Calcein AM／EthD－Ⅱ細(xì)胞活性／毒性檢測 上述各組細(xì)胞培養(yǎng)后，去除培養(yǎng)基，清洗2次～3次。加入Calcein－AM／EthD－Ⅲ溶液，37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞15 min。激光熒光顯微鏡490 nm±10 nm下觀察黃綠色活細(xì)胞，然后545 nm再觀察紅色的死細(xì)胞。每皿隨機(jī)取至少3視野計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞死亡率＝紅色計(jì)數(shù)細(xì)胞／綠色計(jì)數(shù)細(xì)胞＋紅色技術(shù)細(xì)胞×100%。

1.3.5 TUNEL染色 4%多聚甲醛固定細(xì)胞。按照TUNEL染色試劑盒說明進(jìn)行操作。TUNEL陽性率＝綠色計(jì)數(shù)細(xì)胞／藍(lán)色計(jì)數(shù)細(xì)胞×100%。

1.3.6 caspase－1 活 性 檢 測 收 集 細(xì) 胞，根 據(jù)caspase－1試劑盒說明測定各組細(xì)胞caspase－1活性。

1.3.7 ELISA檢測細(xì)胞因子IL－1β及IL－18濃度 將各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)上清，按照人IL－1β及IL－18試劑盒的操作步驟檢測培養(yǎng)上清中IL－1β及IL－18濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)雙復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，根據(jù)方差齊性分析的結(jié)果，進(jìn)一步使用S－N－K檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Treg抑制小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)活化型caspase－1與對照組比較，ox－LDL組巨噬細(xì)胞caspase－1活性明 顯 增 加 （P＜0.001）；與 ox－LDL 組 和 CD25－組比較，CD25＋組細(xì)胞caspase－1活性顯著性減少（P＜0.001）。詳見圖1。

2.2 Treg抑制ox－LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡 與對照組比較，ox－LDL組巨噬細(xì)胞LDH流出及Calcein－AM／EthD－Ⅲ明顯增加（P＜0.001）；與ox－LDL組和 CD25－組比較，CD25＋組細(xì)胞LDH流出及 Calcein－AM／EthD－Ⅲ陽性細(xì)胞數(shù)量顯著性減少（P＜0.001）。詳見圖2。

圖1 Treg對小鼠巨噬細(xì)胞caspase－1活性的影響

圖2 Treg對小鼠巨噬細(xì)胞LDH流出及Calcein－AM／EthD－Ⅲ陽性細(xì)胞的影響

2.3 Treg抑制ox－LDL誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞TUNEL陽性表達(dá) TUNEL染色表明：與對照組TUNEL陽性細(xì)胞 （4.28±0.59）% 比 較，100 μg／mL ox－LDL 組TUNEL陽性細(xì)胞（1 6.6 9±1.3 1）%顯著增加（P＜0.05）；與ox－LDL組和 CD25－組（25.53±2.28）%比較，CD25＋組細(xì)胞TUNEL陽性細(xì)胞（10.02±1.03）%明顯減少（P＜0.01）。

2.4 Treg抑制ox－LDL誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞IL－1β、IL－1 8分泌 與對照組比較，ox－LDL組巨噬細(xì)胞IL－1β、IL－18水平明顯增加（P＜0.001）；與ox－LDL組和CD25－組比較，CD25＋組細(xì)胞IL－1β、IL－18水平顯著減少（P＜0.001）。詳見表1。

表1 各組IL－1β及IL－18水平比較（x±s） ng／L

3 討 論

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是近年來發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的新的細(xì)胞死亡方式，其發(fā)生依賴于天冬半胱酶－1（caspase－1）激 活，伴 隨IL－1β、IL－18 等 炎 癥 因 子 分泌［7］。焦亡形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放以及caspase－1作用于骨架蛋白DNA致使形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為TUNEL陽性。目前研究已證實(shí)，焦亡在人類免疫缺陷病毒（HIV）等病原菌及膽固醇結(jié)晶等非生物性刺激原介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用［7］，但其是否參與AS細(xì)胞死亡目前尚無研究。

ox－LDL大量存在于AS斑塊局部，是促AS作用最強(qiáng)的刺激原之一。研究表明ox－LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生死亡，大多學(xué)者認(rèn)為ox－LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡方式為凋亡，其依據(jù)為TUNEL染色陽性增加［7］。但是，細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放以及胞內(nèi)微器官破壞等非凋亡形態(tài)學(xué)特征同樣可見于ox－LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞報道中［8］。盡管有學(xué)者提出“凋亡后壞死”，但是體外研究表明給予凋亡關(guān)鍵酶阻斷劑及其他凋亡途徑蛋白酶阻斷劑并不能抑制ox－LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡［9，10］。上述研究提示細(xì)胞其他死亡方式可能參與ox－LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，ox－LDL組巨噬細(xì)胞caspase－1的活性顯著增高，LDH流出及Calcein－AM／EthDⅢ染色陽性細(xì)胞顯著增加；TUNEL陽性細(xì)胞顯著增高；同時細(xì)胞因子檢測IL－1β和IL－18明顯增高。以上結(jié)果表明ox－LDL可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡細(xì)胞死亡方式，其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

Treg在調(diào)控動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)和發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究已證實(shí)Treg可以抑制ox－LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化［6，10］，但是 Treg對 ox－LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡的影響及機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)中，與單獨(dú)氧化型低密度脂蛋白刺激比較，與Treg共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞caspase－1活性明顯受抑制；其細(xì)胞死亡也明顯減少，表現(xiàn)為LDH流出減少以及Calcein－AM／EthDⅢ染色陽性數(shù)量減少；同時細(xì)胞因子檢測表明Treg也可抑制ox－LDL導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞IL－1β和IL－18分泌，相反，CD4＋CD25－效應(yīng)性T細(xì)胞無上述作用。上述結(jié)果提示Treg可抑制氧化型低密度脂蛋白導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞焦亡，此作用可能是Tregs抗AS機(jī)制之一。

綜上所述，本研究證實(shí)ox－LDL可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡；Treg可抑制ox－LDL導(dǎo)致的小鼠巨噬細(xì)胞焦亡。上述發(fā)現(xiàn)不僅有助于進(jìn)一步明確AS細(xì)胞死亡機(jī)制，還有助于闡明Treg在AS發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用，而且為AS的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

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