陳立英，王會(huì)軍，陶小雪，廖仁昊，張 穎，崔妍莉，劉芳芳

預(yù)先給予短暫的腦缺血預(yù)處理（BIP）可誘導(dǎo)缺血耐受（IT）［1］，激活內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，減輕缺血再灌注所致的腦損傷，但人為地誘發(fā)IT是非常困難和難以想象的，在臨床上實(shí)施困難。近年來發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予一些藥物也可誘導(dǎo)IT，此現(xiàn)象稱為藥物預(yù)處理［2］，研究表明阿司匹林（ASA）可誘導(dǎo)IT，具有直接神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能為ASA的抗炎作用可減輕腦缺血再灌注后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)［3］。中藥大黃素甲醚（plyscion，Ply）屬蓼科植物大黃根莖所含的蒽醌衍生物之一，并具有很強(qiáng)的抗炎作用，已有前期研究證明Ply通過抗炎機(jī)制而起到腦保護(hù)作用［4］，但對(duì)IT的影響報(bào)道尚少見。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠缺血再灌注模型，觀察不同預(yù)處理方式對(duì)大鼠缺血再灌注損傷保護(hù)作用的影響，為缺血性腦血管的治療提供了一種有前途的新方法。

1 材料與方法

1.1 模型制造 將100只健康成年雄性SD大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）按隨機(jī)數(shù)值表法分為5組，每組20只。A組：假手術(shù)組，B組：腦缺血再灌注組，假手術(shù)3d后給予2h大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO），再灌注22h后處死。C組：腦缺血預(yù)處理組，缺血預(yù)處理10min，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。D組：ASA預(yù)處理組，阿司匹林粉劑（河南華利藥業(yè)有限責(zé)任 公 司 提 供，批 號(hào)：0780633）以 60mg／kg 劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2h MCAO，再灌注22h后處死。E組：Ply預(yù)處理組，大黃素甲醚（山東新華制藥股份有限公司提供，批號(hào)：0506338；以40mg／kg劑量溶于2mL生理鹽水中，灌胃3次，3d后給予2hMCAO，再灌注22h后處死。給予A、B、C組等量生理鹽水灌胃。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用10%水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，用Zea－longa等［5］的大腦中動(dòng)脈線栓法制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血灌注模型。采用頸部正中切口，結(jié)扎并切斷左側(cè)頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈殘端剪一小口，并插入一根頂端粘有石蠟的尼龍絲線，向上深入至分叉以上（19～21）mm，結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，缺血（以插漁線成功開始計(jì)時(shí)）后2h實(shí)施再灌注，外拉漁線約20 mm恢復(fù)MCA供血，完成缺血預(yù)處理。假手術(shù)組除不插入漁線外，其余操作相同。造模成功標(biāo)志：大鼠不能伸展右側(cè)前肢（即提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲）、行走時(shí)向向右轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象）或行走時(shí)向右側(cè)傾倒，出現(xiàn)上述三者之一即為造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h，于處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，心臟取血，后斷頭處死。

1.2 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 按Zea Long5分制［5］標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，0分：無功能障礙；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.3 腦梗死體積測(cè)定 再灌注22h每組隨機(jī)選取10只動(dòng)物斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，沿冠狀面用排刀切成5片，每片厚約2mm，置于2%TTC溶液中，避光染色30min，用10%甲醛緩沖液固定24h后用數(shù)碼相機(jī)照相，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色，利用圖像分析法計(jì)算各個(gè)腦片梗死面積，并計(jì)算梗死體積。

1.4 腦組織白細(xì)胞介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量測(cè)定 再灌注22h后取每組另10只動(dòng)物用10%的水合氯醛麻醉后處死，取出鼠腦剝離左側(cè)皮質(zhì)，制成100g／L的腦組織勻漿，低溫離心1 5min（3 000r／min）。取上清液采用FFDFr－晶體閃爍計(jì)數(shù)儀，用放射免疫法測(cè)定各組動(dòng)物腦組織IL－1β和TNF－α的含量。具體操作按大連生物工程公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組比較進(jìn)行單因素方差分析及兩兩比較q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分 假手術(shù)組無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。缺血預(yù)處理組、ASA預(yù)處理組及Ply預(yù)處理組神經(jīng)功能缺失評(píng)分與缺血再灌注組比較明顯降低（P＜0.01）。Ply預(yù)處理組神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯降低，與ASA預(yù)處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 血清NSE含量 腦缺血再灌注組血清NSE含量與假手術(shù)組比較明顯升高 （P＜0.05）。缺血預(yù)處理組、ASA預(yù)處理組及Ply預(yù)處理組與腦缺血再灌注組比較血清NSE含量降低（P＜0.01）。Ply預(yù)處理組血清NSE含量與ASA預(yù)處理組比較明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 腦梗死體積 假手術(shù)組無肉眼可見的梗死灶形成。腦缺血再灌注組大鼠均表現(xiàn)不同程度的梗死灶形成。缺血預(yù)處理組、ASA預(yù)處理組及Ply預(yù)處理組與腦缺血再灌注組比較梗死體積縮?。≒＜0.01）。Ply預(yù)處理組梗死體積與ASA預(yù)處理組比較明顯縮?。≒＜0.05）。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺失、NSE、腦梗死體積比較（x±s）

2.4 腦組織IL－1β和TNF－α含量 腦缺血再灌注組腦組織IL－1β和TNF－α含量與假手術(shù)組比較明顯升高（P＜0.01）。缺血預(yù)處理組、ASA預(yù)處理組及Ply預(yù)處理組與腦缺血再灌注組比較病變側(cè)腦組織IL－1β和 TNF－α含量降低 （P＜0.05）。Ply預(yù)處理組腦組織IL－1β和TNF－α含量與ASA預(yù)處理組比較明顯降低 （P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組腦組織IL－1和TNF－α含量（x±s） ng／mL

3 討 論

BIP是指對(duì)腦組織采用機(jī)械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，使其對(duì)以后較長(zhǎng)時(shí)間的缺血性損傷產(chǎn)生IT［1］。其機(jī)制之一為抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)作用，減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提前給予BIP可以使再次缺血時(shí)神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。近年來發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予一些藥物也可誘導(dǎo)IT，此現(xiàn)象稱為藥物預(yù)處理［2］，研究表明ASA具有這種作用。提前給予ASA預(yù)處理可同樣使再次缺血時(shí)神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較缺血再灌注損傷組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

炎癥反應(yīng)可能在缺血再灌注損傷及腦IT中具有重要意義，抗炎治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷［6］。Ply屬蓼科植物大黃的根及根莖所含的蒽醌衍生物之一，可通過血腦屏障，并具有很強(qiáng)的抗炎作用。已有前期研究證明Ply通過抗炎機(jī)制而起到腦保護(hù)作用［4］，但對(duì)IT的影響報(bào)道尚少見。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提前給予Ply預(yù)處理可以使再次缺血時(shí)神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小，血清NSE含量下降，均較ASA預(yù)處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中藥Ply亦可誘導(dǎo)IT產(chǎn)生腦保護(hù)作用，效果優(yōu)于ASA。

腦缺血后的再灌注損傷是一系列復(fù)雜的病理過程，主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝障礙、炎性反應(yīng)、興奮性氨基酸釋放、細(xì)胞凋亡及突觸傳遞受阻等有關(guān)［7］。其中炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一個(gè)重要的損傷機(jī)制，各種炎癥因子的釋放在損傷機(jī)制中起著重要作用，一方面促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，機(jī)械性堵塞微循環(huán)通道，影響組織的血流供應(yīng)；另一方面促進(jìn)相關(guān)炎性因子釋放，導(dǎo)致白細(xì)胞在缺血區(qū)浸潤(rùn)和聚集，活化的白細(xì)胞在缺血區(qū)可釋放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物質(zhì)而進(jìn)一步損傷局部組織血管，導(dǎo)致血管通透性增加而致組織水腫，加重組織損傷［8］。在炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)中以炎性細(xì)胞因子（如IL－1β、TNF－α）表達(dá)上調(diào)為首發(fā)特征，IL－1β、TNF－α作為炎癥反應(yīng)的起始因子，檢測(cè)其含量對(duì)衡量腦缺血再灌注損傷有重要意義［9］。本實(shí)驗(yàn)采用放射免疫分析法動(dòng)態(tài)觀察了不同預(yù)處理方式對(duì)大鼠腦缺血再灌注側(cè)腦組織IL－1β和TNF－α含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注腦組織中IL－1β和TNF－α含量明顯升高，且均高于假手術(shù)組（P＜0.01）。缺血預(yù)處理組、ASA預(yù)處理組及Ply預(yù)處理組與腦缺血再灌注組比較病變側(cè)腦組織IL－1β和TNF－α含量降低 （P＜0.05）。該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致［10］。表明IL－1β、TNF－α參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，在腦缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起一定的作用。而不同方式的預(yù)處理可能通過降低IL－1β和TNF－α在病灶側(cè)的過度表達(dá)，并對(duì)隨后發(fā)生的腦缺血再灌注損傷起保護(hù)性作用。

通過對(duì)不同方式預(yù)處理的比較，藥物預(yù)處理具有相對(duì)安全、方便、易于控制劑量的優(yōu)點(diǎn)，且中藥Ply具有更加廣闊的發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)有可能對(duì)臨床缺血性腦血管病的防治提供新的依據(jù)。

［1］ Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，etal.Ischemic tolerance phenomenon found in the brain［J］.Brain Res，1990，528（2）：21－24.

［2］ Zhao X，Strong R，Piriyawat P，etal.Caffeinol at the receptor level：Anti－ischemic effect of N－methy1－D－aspartate recepfor blockade is potentiated by caffeine［J］.Stroke，2010，41（2）：363－367.

［3］ 徐濤，曲方，周中和，等.阿司匹林對(duì)腦缺血－再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制［J］.中國(guó)腦血管病雜志，2006，3：267－272.

［4］ 呂若華，蘇鉅年，周曉雯，等.大黃素甲醚對(duì)新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)作用的靶點(diǎn)研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)雜志，2012，15：1730－1734.

［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainietomy in rats［J］.Stroke，1989，20 （1）：84－91.

［6］ Huang J，Upadhyay UM，Tamargo RJ.Inflammation in strok and focal cerebral ischemia ［J］.Surg Neurol，2006，2006（3）：232－245.

［7］ Liao SL，Chen WY，Raung SL，etal.Association of immune reaponses and ischemic brain infarction in rat［J］.Neuroreport，2001，12（9）：1943－1947.

［8］ Gao XM，Liu Y，White D，etal.Deletion of macrophage migration inhibitory factor protects the heart from severe is chemiareperfusion injury：A predonminant role of anti－in flammation［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，50（6）：991－999.

［9］ Folkersma H，Breve JJ，Tilders FJ，etal.Cerebral microdialysis of interleukin（IL）－1beta and IL－6：Extraction efficiency and production in the acute phase after severe traumatic brain injury in rats［J］.Acta Neurochir，2008，150（12）：1277－1279.

［10］ Oshima T，Lee S，Sato A，etal.TNF－alpha contributes to axonal sprouting and functional recovery following traumatic brain injury［J］.Brain Res，2009，1290（1）：102－104.