王娟 程崗 王亞明 方丹東 李志超 張劍寧

·基礎(chǔ)研究·

創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠腦線粒體功能的變化

王娟 程崗 王亞明 方丹東 李志超 張劍寧

目的通過改進型Feeney自由落體腦損傷裝置制作大鼠重型顱腦損傷模型，檢測損傷后不同時間點腦皮質(zhì)組織線粒體功能的變化。方法雄性SD大鼠30只，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=5)和創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)組(n=25)，TBI組按傷后不同時間點(12 h、1 d、3 d、5 d、7 d)又分為5個亞組，每組分別5只動物。采用尼氏染色觀察神經(jīng)細胞損傷；采用多功能酶標儀檢測線粒體膜電位(MMP)、H+-ATPase活性、三磷酸腺苷(ATP)含量，觀察TBI后腦皮質(zhì)線粒體功能的變化。結(jié)果TBI后尼氏染色結(jié)果顯示，腦皮質(zhì)神經(jīng)元染色12 h組較假手術(shù)組神經(jīng)元減少，1 d組更少，3 d組染色最少。MMP、H+-ATPase活性、ATP含量在傷后均下降，且3 d組最低，相較于假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論TBI后腦皮質(zhì)線粒體功能呈現(xiàn)先下降、后上升的趨勢，尚可恢復(fù)部分功能，這對TBI后腦保護的機制研究提供了一定的實驗基礎(chǔ)，對腦損傷者進行有效的保護至關(guān)重要。

線粒體；大鼠；顱腦創(chuàng)傷

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是指由外傷因素而引起的腦組織損傷。它是神經(jīng)外科最常見的疾病，也是導致創(chuàng)傷患者傷殘及死亡的主要原因。TBI引起一系列復(fù)雜的病理機制，包括興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用、線粒體功能障礙、氧自由基堆積、炎性因子刺激等[1]。眾多的研究顯示，線粒體能量代謝障礙在TBI的繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮著重要作用，而觀察不同時期線粒體的功能的變化趨勢對研究能量代謝障礙至關(guān)重要。本研究針對創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠腦線粒體的改變進行分析，以期發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律和意義。

材料與方法

一、實驗材料

1.動物：成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF級)，3～4個月齡，體質(zhì)量220～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

2.試劑及儀器：羅丹明123、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)購于Sigma公司(美國)；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)檢測試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)研究所。其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。多功能酶標儀varioskan購于Thermo公司；臺式冷凍離心機CR22G購于HITACHI公司；TLL-C臺式高速冷凍離心機購于北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。以上儀器均由軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)研究所應(yīng)激醫(yī)學教研室提供。

二、實驗方法

1.動物分組：選擇雄性SD大鼠30只，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=5)和TBI組(n=25)，TBI組按傷后不同時間點(12 h、1 d、3 d、5 d、7 d)又分為5個亞組，每組分別5只動物。各組動物實驗期間均處于相同飼養(yǎng)環(huán)境，并給予充足的飼料和飲用水。

2.動物模型：所有動物注射麻醉劑后固定于腦立體定位儀，頭部備皮并常規(guī)消毒。沿中線切開頂部頭皮，人字縫及冠狀縫中線旁開左側(cè)頂骨3 mm，用牙科鉆打開一直徑5 mm的骨窗。單純TBI組參照Feeney自由落體腦損傷裝置[2]，制作改進型Feeney自由落體腦損傷裝置[3]，打擊強度為20 g× 35 cm，致輕至中度腦損傷模型。假手術(shù)組僅鉆開骨窗，而不打擊致傷，同1 d組處死。

2.組織切片制備及尼氏染色：動物麻醉后開胸腔經(jīng)心快速注入250 ml生理鹽水，再4%多聚甲醛灌注。斷頭取腦，后固定2 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、冠狀切片，切片厚度6 μm。制備焦油紫工作液，切片放入，37℃6 h后取出洗去浮色，70%酒精洗滌，分色液去底色。逐級酒精脫水、透明、封片。相鄰切片行HE染色。

3.線粒體提取及測定：動物達致傷時間點后迅速斷頭取腦，4℃的生理鹽水中洗滌數(shù)次，取損傷側(cè)大腦半球去除腦干和小腦，皮層稱重后立即剪碎(0.1 mm3)、勻漿，加入12 ml懸浮緩沖液，冰浴下勻漿，梯度差速離心后，所得沉淀物即為線粒體。使用2 ml懸浮緩沖液輕輕吹打致所有沉淀懸浮待用。

檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)：參照Clark等[4]方法，線粒體懸液使用Bradford法蛋白定量。檢測板中加入200 μl反應(yīng)液，再加入0.2 mmol/L羅丹明123 1 μl，混勻后測定基礎(chǔ)熒光值F1(激發(fā)波長為507 nm，發(fā)射波長為530 nm)。加入線粒體200 μg，混勻后室溫避光下孵育20 min，再次測定熒光值F2。ΔΨm(ΔΨm=F1－F2)反應(yīng)線粒體膜電位的大小。

檢測線粒體H+-ATPase活性：稀釋液按1：100的比例配適量的ATP檢測工作液。檢測板中加入工作液100 μl，室溫避光放置。加入10 μl稀釋后的線粒體懸液及1 μl ADP溶液(1 mmol/L)，混勻。檢測發(fā)光強度，設(shè)定為15 s/次，共測10次。繪制的曲線，以斜率表示線粒體H+-ATPase活性。

4.ATP提取及含量檢測：取30 mg皮層組織稱重后立即剪碎(0.1 mm3)，電動勻漿器中加入ATP裂解液冰浴勻漿。12 000×g，4℃離心15 min后，取全部上清液。配置梯度ATP標準液、ATP檢測試劑工作液。檢測板中加入工作液100 μl，每孔加入6個濃度梯度的ATP標準液及樣品100 μl混勻，檢測發(fā)光強度，根據(jù)標準曲線計算各組ATP的總含量A (nmol)。用BCA法測定各組的蛋白總量B(mg)。ATP的含量用A/B來表示。

三、統(tǒng)計分析

采用SPSSl7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。MMP、H+-ATPase、ATP含量符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間比較應(yīng)用方差分析，組內(nèi)比較應(yīng)用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、傷后動物狀態(tài)的改變

腦損傷組動物手術(shù)后均存活，未出現(xiàn)顱骨骨折。撞擊傷后出現(xiàn)短暫的呼吸暫停(約5～10 s)，隨即可恢復(fù)至正常呼吸頻率；傷后心率同傷前無明顯變化。手術(shù)后3～4 h動物蘇醒，當天活動少，步態(tài)紊亂，刺激反應(yīng)稍減弱。傷后1～3 d動物均可自由進食、飲水，較傷前飲食減少，無肢體癱瘓或活動受限。假手術(shù)組動物麻醉蘇醒后，全身狀態(tài)良好，飲食狀況較好，反射活動正常，后肢協(xié)調(diào)性良好。實驗過程中無動物死亡。

二、病理改變

取材時可見相較于假手術(shù)組，傷后12 h左側(cè)頂葉受撞擊處皮質(zhì)呈紫紅色，明顯腫脹；傷后1 d受撞擊處皮質(zhì)呈紫紅色且腫脹，但是較12 h組稍淺。兩組鏡下觀察，挫裂傷灶周圍皮質(zhì)及皮質(zhì)下白質(zhì)均有不同程度的出血，胼胝體、小腦上臂、腦干等處可見散在的點片狀出血灶，符合TBI改變。傷后3 d，出血基本吸收。傷后5 d、7 d，肉眼可見已無出血灶，鏡下可見壞死空洞被類似纖維肉芽組織物所填充。

尼氏染色結(jié)果顯示，TBI組腦皮質(zhì)神經(jīng)元染色顯示先減少后稍增多。12 h組較假手術(shù)組神經(jīng)元減少，細胞輪廓清楚；1 d組更少；3 d組染色最少，僅顯示與底色相似的淺藍色胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，增生膠質(zhì)細胞核染色明顯；5 d神經(jīng)元可見較3 d時增多，但仍比假手術(shù)組少；7 d組較5 d組增多，但仍比假手術(shù)組少。

三、線粒體MMP檢測結(jié)果

TBI組較假手術(shù)組線粒體膜電勢呈現(xiàn)先下降、后上升。傷后12 h時線粒體膜電位較假手術(shù)組稍有升高；1 d、3 d、5 d組的下降均較假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)，3 d組最低；各組間線粒體功能無顯著變化。這說明TBI后大鼠腦組織線粒體功能先一過性升高，再下降(P＜0.05)，一定時間后逐漸恢復(fù)線粒體功能，卻不能達到未損傷前水平(圖1)。

圖1 TBI后大鼠腦組織中線粒體膜電位的變化

四、線粒體H+-ATPase活性的改變

TBI組較假手術(shù)組大鼠腦線粒體H+-ATPase活性呈現(xiàn)先下降、后上升的趨勢。1 d、3 d組的下降均相較于假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)，3 d組最低；各組組間線粒體功能無顯著變化。TBI后大鼠腦組織線粒體功能顯著下降，一定時間后可逐漸恢復(fù)線粒體功能，卻不能達到未損傷前水平(圖2)。

五、線粒體ATP含量測定

TBI組較假手術(shù)組線粒體ATP含量呈現(xiàn)先下降、后上升的趨勢。1 d、3 d、5 d、7 d組的下降均相較于假手術(shù)組有顯著性差異，且3 d組最低；各組組間線粒體功能無顯著變化。這說明TBI后大鼠腦組織線粒體功能呈現(xiàn)顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但在一定時間后可逐漸恢復(fù)線粒體功能，卻不能達到未損傷時水平(圖3)。

圖2 TBI后大鼠腦組織中線粒體H+-ATPase活性的變化

圖3 TBI后大鼠腦組織中ATP含量的變化

討論

TBI發(fā)生率及致死、致殘率之高成為了當今威脅人類生命健康的重要疾患之一[5]。TBI也是最常見的創(chuàng)傷類型，其發(fā)生率明顯高于其他部位的創(chuàng)傷，且以開放性顱腦外傷為主[6]。TBI后一系列復(fù)雜的病理機制相繼發(fā)生，包括興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用、氧自由基堆積、炎性因子刺激、線粒體功能障礙等。繼發(fā)性腦損傷表現(xiàn)為傷后一系列復(fù)雜的病理生理學過程，是腦損害發(fā)生、發(fā)展的重要原因。

線粒體中的一系列代謝過程與細胞凋亡密切相關(guān)，如呼吸鏈中氧自由基的過度生成、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔異常開放、凋亡誘導因子與線粒體細胞色素C釋放等。TBI后繼發(fā)性損傷中，細胞興奮毒性、Ca2+超載、活性氧、Bcl-2家族及凋亡誘導因子均參與以線粒體為中心的細胞損傷過程。腦線粒體缺氧在早期主要是由于創(chuàng)傷后腦水腫、腦腫脹、顱內(nèi)壓升高、腦血管舒縮功能障礙以及傷后呼吸暫停窒息等原因造成的急性缺氧，此后由于細胞代謝產(chǎn)物積聚加重缺氧而出現(xiàn)慢性缺氧。越來越多的臨床研究證實腦線粒體的功能障礙與許多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[8]。近期有研究發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中線粒體的裂解數(shù)量增加，抑制線粒體的裂解在大腦皮層缺血后再灌注情況下能保護皮層神經(jīng)元[9]。另有研究表明，抑制線粒體Ca2+單向轉(zhuǎn)運體可以保護大腦免受缺血后再灌注損傷，減少梗死面積、自由基的生產(chǎn)和線粒體腫脹[10]。故而，在繼發(fā)性腦損傷后這一階段研究神經(jīng)細胞，特別是細胞功能障礙方面，如線粒體功能變化，對于保護TBI后損傷的神經(jīng)元細胞并且修復(fù)、治療有重要的實際意義。

本實驗中建立了輕至中度腦損傷動物模型，選擇多個時間點來觀察TBI后皮質(zhì)組織中細胞線粒體的功能變化，觀察到不同時間點的表達變化。本實驗著重對線粒體功能的幾個重要指標進行觀測，相較以往的實驗研究，能更直觀地反映線粒體功能。隨著損傷時間的延續(xù)，發(fā)現(xiàn)線粒體MMP、ATP含量以及線粒體H+-ATPase活性都反映出相同的變化趨勢。結(jié)果說明TBI后由于一定的應(yīng)激性反應(yīng)，大鼠腦組織線粒體功能先一過性升高，再顯著下降，但在一定時間后可逐漸恢復(fù)線粒體功能，卻不能達到未損傷前水平。

綜上所述，觀察到損傷后不同時間點的線粒體功能變化，這對于進一步研究損傷區(qū)域神經(jīng)元細胞的修復(fù)有重要的意義。其中，損傷后3 d的線粒體各項功能最低點是采取保護性措施的重要依據(jù)。有研究報道，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后，若能早期阻滯繼發(fā)性腦損傷，患者的預(yù)后會得到極大地改善[11]。這也對進一步損傷后腦保護的治療提供一定的實驗基礎(chǔ)，為今后能在損傷早期采取治療措施有著重要的意義。

[1]Yokobori S,Mazzeo AT,Gajavelli S,et al.Mitochondrial neuroprotection in traumatic brain injury：rationale and therapeutic strategies[J].CNS Neurol Disord Drug Targets, 2014,13(4)：606-619.

[2]Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury：I.Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1)：67-77.

[3]王清華,徐如祥,李良平,等.大鼠不同程度腦損傷模型的建立[J].創(chuàng)傷外科雜志,2000,2(1)：42-44.

[4]Clark JB,Nicklas WJ.The metabolism of rat brain mitochondria.Preparation and characterization[J].J Biol Chem, 1970,245(18)：472-473.

[5]張劍寧,程崗.我國海上顱腦戰(zhàn)創(chuàng)傷研究現(xiàn)狀[J].中華神經(jīng)外科雜,2012,28(2)：211-213.

[6]McCarthy ML,Dikmen SS,Langlois JA,et al.Self-reported psychosocial health among adults with traumatic brain injury [J].Arch Phys Med Rehabil,2006,87(7)：953-961.

[7]Cheng G,Kong RH,Zhang LM,et al.Mitochondria in traumatic brain injury and mitochondria-targeted multipotential therapeutic strategies[J].Br J Pharmacol,2012,167(4)：699-719.

[8]Reddy PH,Reddy TP.Mitochondria as a therapeutic target for aging and neurodegenerative diseases[J].Curr Alzheimer Res, 2011,8(17)：393-409.

[9]Zhao Q,Wang S,Li Y,et al.The role of the mitochondrial calcium uniporter in cerebral ischemia/reperfusion injury in rats involves regulation of mitochondrial energy metabolism[J]. Mol Med Rep,2013,7(4)：1073-1080.

[10]Yu N,Wang S,Wang P,et al.The calcium uniporter regulates the permeability transition pore in isolated cortical mitochondria [J].Neural Regen Res,2012,7(2)：109-113.

[11]Sehba FA,Hou J,Pluta RM,et al.The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage[J].Prog Neurobiol, 2012,97(1)：14-37.

Changes of mitochondrial function in rat brain after traumatic brain injury

Wang Juan, Cheng Gang,Wang Yaming,Fang Dandong,Li Zhichao,Zhang Jianning.
Department of Neurosurgery,NavyGeneral Hospital,Beijing 100048,China
Corresponding author:Zhang Jianning,Email:zhangjianning@163.com

ObjectiveTo set up severe rats traumatic brain injury(TBI)model through modified Feeney free fall brain injury device and investigate the pathogenesis on brain cortical tissue mitochondrial function changes in different time.MethodsThirty adult male Sprague-Dawley(SD) rats were used in the study and randomly divided into 2 groups,sham operation group(n=5)and TBI group(n=25).TBI group was divided into five subgroups at different time points after injury(12 h,1 d, 3 d,5 d,7 d)and five rats in each subgroup.The damage of neuron was observed by Nepal's staining. Mitochondrial membrane potential(MMP),H+-ATPase activity and adenosine triphosphate(ATP) content were tested by multifunctional enzyme-labeled instrument to observe the changes of cerebral cortex mitochondria after TBI.ResultsThe post-TBI Nissl staining showed that compared with the sham group,the cortical neurons reduced in staining 12 h group,1 d group more less,and 3 d group was the least.The MMP,activity of H+-ATPase and the content of ATP all decreased after injury,and 3 d group was the least,which had a significant difference compared to the sham operation group(P＜0.05).ConclusionsThe post-TBI mitochondrial function in cerebral cortex first decreased and then increased,which can restore some function.This has provide a certain experimental basis on the research of post-TBI brain protection mechanism,and showed an importance to effective protection on brain injury patients.

Mitochondia;Rats;Craniocerebral trauma

2015-02-13)

(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.02.009

國家自然科學基金資助項目(81372128)

100048北京，海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科

張劍寧，Email：zhangjianning@163.com

王娟,程崗,王亞明,等.創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠腦線粒體功能的變化[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(2)：91-94.