李超 歐陽佳 朱軍

激活低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1依賴的細(xì)胞信號通路可促進(jìn)軸突生長及神經(jīng)損傷修復(fù)

李超1歐陽佳2朱軍1

目的初步探討低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(LRP1)依賴的信號通路對軸突生長及神經(jīng)損傷修復(fù)的作用。方法在培養(yǎng)胎鼠皮層神經(jīng)元過程中加入LRP1激動(dòng)劑RBD，觀察其與對照組相比能否促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長及其信號機(jī)制，此外通過制作小鼠脊髓損傷模型并予以鞘內(nèi)注射RBD，觀察其對神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。結(jié)果體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中加入RBD后引起神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkC，Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的活化，其與對照組相比定量分析表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)，促進(jìn)神經(jīng)突的生長。鞘內(nèi)注射RBD后小鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)評分也明顯提高(P＜0.05)。結(jié)論激活LRP1依賴的信號通路可明顯促進(jìn)軸突生長及小鼠脊髓損傷后的功能修復(fù)。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1；脊髓損傷；行為學(xué)；創(chuàng)傷修復(fù)

低密度脂蛋白受體廣泛存在于包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的細(xì)胞中，并在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。近幾年研究顯示此受體系統(tǒng)在調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，包括細(xì)胞信號及功能等方面有著重要作用[1]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1)條件性缺失，小鼠神經(jīng)元?jiǎng)t表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝改變，突觸消失及神經(jīng)變形等。LRP1受體也存在于膠質(zhì)細(xì)胞，最近研究報(bào)道LRP1的活化可以磷酸化神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkA，并且外周神經(jīng)損傷后施旺細(xì)胞表達(dá)的LRP1被證實(shí)與損傷修復(fù)和再生相關(guān)[3-4]。然而，LRP1依賴的細(xì)胞信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面的研究報(bào)道并不多見。在此重要發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上我們提出假設(shè)：LRP1活化可以激活神經(jīng)元中的神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路并在脊髓損傷后可以促進(jìn)軸突的再生。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕齡2周及成年雌性C57小鼠清潔級，購于維通利華公司。

二、試劑與設(shè)備

無血清培養(yǎng)基(DMEM)粉劑、胎牛血清、購自Gibco公司；anti-LRP1和NF200購于美國Abcam公司，二甲基亞砜(DMSO)、NMDA、甘氨酸、谷氨酰胺、多聚賴氨酸、胰蛋白酶購自Sigma公司；阿糖胞酐購自Pharmacia Bio公司。激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)，DG3022A酶聯(lián)免疫檢測儀(國營華東電子管廠)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，熒光相差顯微鏡(日本Olympus)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

首先，通過體外試驗(yàn)確定LRP1激動(dòng)劑RBD (the LRP1 binding domain，RBD)是否能夠促進(jìn)胎鼠皮層神經(jīng)元軸突生長及其通過LRP1受體激活的信號通路機(jī)制，其次通過體內(nèi)試驗(yàn)評估C57脊髓損傷小鼠鞘內(nèi)注射LRP1激動(dòng)劑RBD后能否促進(jìn)其功能恢復(fù)。

1.原代皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)：皮質(zhì)放置在35 mm無菌培養(yǎng)皿中(含有冷的無血清高糖DMEM)，剪成大約1 mm小塊，把組織吸出到另一個(gè)培養(yǎng)皿中，去除培養(yǎng)基，加入2 mg/ml木瓜蛋白酶1 ml，消化37℃30 min，然后加入200 μl的2.5 mg/ml DNase I 30 s，最后，加入1 ml FBS終止消化。然后將培養(yǎng)皿內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，加入10 ml高糖DMEM培養(yǎng)基，用100 μm細(xì)胞過濾器放在50 ml離心管過濾掉所有的剩余組織碎片。800轉(zhuǎn)離心5 min，棄掉上清。0.1 mg/ml L-PLL加入6孔板中37℃孵育過夜。然后用HBSS洗兩遍，每平方厘米接種50 000細(xì)胞，neurobasal培養(yǎng)基(含有10%B27 supplement和100 μ/ml P/S)孵育，3 d換液1次。以處理因素不同共分為4組，為對照組(未做處理)，拮抗劑組中加入LRP1拮抗劑(receptor associated protein，RAP) (200 nmol/L)，激動(dòng)劑組中加入RBD(100 nmol/L)，以及RAP和RBD共同刺激組。

2.脊髓損傷模型手術(shù)過程：成年雌性C57小鼠18只，用3.6%的水合氯醛麻醉后，放在電熱毯上，于整個(gè)手術(shù)過程中維持體溫在37℃。減去術(shù)區(qū)毛發(fā)并用75%酒精消毒3次，切開皮膚并去除皮下脂肪，分離肌肉組織充分暴露T9-T10節(jié)段的椎板，用顯微紋氏鉗咬除T10椎板，并小心打開硬脊膜避免損傷脊髓，然后用顯微刀片對脊髓進(jìn)行背側(cè)半切，達(dá)中央管水平，此種模型可以破壞損傷節(jié)段以下的皮質(zhì)脊髓束，背側(cè)柱，紅核脊髓束及部分網(wǎng)狀脊髓束，同時(shí)于損傷處鞘內(nèi)植入Alzet微量泵，分別予以鞘內(nèi)注射RBD(5 μmol/L，n=10)及生理鹽水(n=8)，考慮到隨著植入時(shí)間的延長，會對損傷局部產(chǎn)生炎癥刺激，故兩組均于術(shù)后第5天取下微量泵。

3.免疫熒光染色：將T10節(jié)段厚度10 μm的脊髓冰凍切片在PBS中沖洗后，用10%的小牛血清(BSA)室溫封閉1 h，然后用2%BSA和0.2%的PBS-Triton稀釋的anti-neurofilament-200(NF200)和anti-LRP1孵育過夜，過后用Alexa Flour 488/555熒光二抗室溫孵育1 h，最后用Dapi封片。

4.細(xì)胞免疫化學(xué)染色：將培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，0.1%Triton破膜30 min，PBS沖洗后，滴加5%的BSA室溫1 h，然后加入anti-NF200并于4孵育過夜，過后用熒光二抗Alexa Flour 488孵育1 h，PBS沖洗3次后Dapi封片。

5.Western blotting：收集細(xì)胞裂解后提取蛋白并檢測蛋白濃度，將30 μg的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。加入Anti-pTrkC(1：1 000，Cell Signaling Technology)，anti-tTrkC(CST)，pERK或tERK (1：1 000，CST)。并4℃冰箱孵育過夜，相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST沖洗3次5 min，并用ECL顯色后，由quantity-one軟件系統(tǒng)計(jì)算分析蛋白表達(dá)量。

6.行為學(xué)檢測：所有小鼠在手術(shù)前均接受訓(xùn)練，將其放入曠場中每天分為十個(gè)訓(xùn)練部分，每個(gè)部分5 min，為術(shù)后檢測其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的曠場實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，還于步態(tài)儀上進(jìn)行步態(tài)訓(xùn)練，每天7個(gè)訓(xùn)練部分，每部分5 min。

(1)曠場實(shí)驗(yàn)：在空曠的場地中對術(shù)后小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的檢測，每只動(dòng)物均在曠場中自由活動(dòng)4 min，通過兩個(gè)觀察者對不同處理組的小鼠的運(yùn)動(dòng)能力予以盲測評分。所有小鼠均與術(shù)后1、3、7、14、21、28 d予以檢測評分。

(2)步態(tài)分析：大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評分(basso monse scale，BMS)大于5分的小鼠方可進(jìn)行此項(xiàng)檢測，此檢測用來評估術(shù)后小鼠感覺運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的恢復(fù)情況，小鼠走過長約1 m的步態(tài)分析儀，錯(cuò)誤步態(tài)(比如踏空)會被電腦自動(dòng)記錄并予以統(tǒng)計(jì)分析，小鼠均于術(shù)后14、21、28天予以檢測。

圖1 LRP-1在對照組、RBD、RAP與RBD+RAP組小鼠的活化程度

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對照組與RBD組，RAP組間的LRP-1，NF200及BMS評分等均數(shù)的比較采用單因素方差分析，用LSD-t檢驗(yàn)比較兩兩之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、LRP1的免疫熒光表達(dá)

LRP1表達(dá)在神經(jīng)元中，活化后增加了神經(jīng)突的生長通過對正常C57小鼠脊髓進(jìn)行LRP1和NF200的免疫熒光雙標(biāo)，顯示LRP1與NF200共定位(圖1A)，證實(shí)其表達(dá)于脊髓神經(jīng)元中。分離的神經(jīng)元培養(yǎng)18 h后，NF200分別標(biāo)記RBD處理組和未處理組后顯示處理組比未處理組神經(jīng)突長2倍以上。(圖1BP＜0.01)在神經(jīng)元培養(yǎng)中我們又增添了單獨(dú)加入LRP1拮抗劑RAP組和RBD&RAP組，結(jié)果顯示，當(dāng)只加入RAP后并未顯示促進(jìn)神經(jīng)突生長的作用，但RAP明顯降低了RBD的促增長效應(yīng)，以上數(shù)據(jù)顯示，LRP1活化明顯促進(jìn)神經(jīng)突的生長。

二、LRP1配體通過反式激活LRP1受體在神經(jīng)元中活化了TrkC信號通路

之前有研究顯示，LPR1依賴的信號通路在PC12細(xì)胞中可以通過反式激活TrkA促進(jìn)神經(jīng)突的生長[5-7]。為了揭示RBD在促進(jìn)C57胎鼠神經(jīng)元中神經(jīng)突生長的分子機(jī)制，進(jìn)一步檢測了LRP1激動(dòng)劑RBD是否可以激活TrkC。在神經(jīng)元培養(yǎng)過程中加入RBD后30 min，對TrkC進(jìn)行定量分析顯示與對照組相比TrkC表達(dá)明顯升高(P＜0.05)(圖2A)，為了確定TrkC的活化是否是LRP1依賴度的信號通路所必須的，進(jìn)一步證實(shí)，加入RBD后明顯激活了ERK，并且這種活化作用可被TrK抑制劑k252a阻止(圖2B)。所以，認(rèn)為LRP1依賴的信號通路需要TrkC的活化。然而，在培養(yǎng)的神經(jīng)元中LRP1激動(dòng)劑可能也可以通過TrkA和B受體激活ERK，但是在聯(lián)合加入RBD和k252a后，pERK幾乎完全降低到基線水平，最終證實(shí)了TrkC的活化在LRP1依賴的信號通路中的重要性。

三、鞘內(nèi)注射RBD促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)

圖2 不同組間采用immunoblot檢測的表達(dá)

圖3 RBD組與對照組小鼠的曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在體外實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)LRP1依賴的信號通路可以促進(jìn)神經(jīng)突的生長，接下來想揭示LRP1激動(dòng)劑是否會促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)，通過曠場試驗(yàn)及步態(tài)分析分別對兩組術(shù)后小鼠的功能修復(fù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，損傷后14 d RBD注射組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較對照組明顯提高(P＜0.05)(圖3)。

討論

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)是LDL受體超家族成員，最初是作為ApoE和淀粉樣蛋白Aβ的內(nèi)吞受體被發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在被認(rèn)為是組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和活化的α2巨球蛋白等多種配體的細(xì)胞信號受體[8-10]。LRP1激活劑通過NPXY的酪氨酸磷酸化激活細(xì)胞信號通路[11]。在施旺細(xì)胞中，LRP1激活PI3K/Akt介導(dǎo)細(xì)胞存活信號通路和抵抗胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[12]。LRP1也可以和其它受體相互作用，包括結(jié)合素類，PDGF受體和uPAR[13]?？傊?，LRP1在細(xì)胞的信號通路、代謝、遷徙和血腦屏障的完整性中都發(fā)揮著重要作用。

LRP1廣泛表達(dá)于未損傷的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，近年來報(bào)道顯示，LRP1可能在神經(jīng)的功能和生長中有重要的作用[14-15]：(1)外周神經(jīng)損傷后LRP1在施旺細(xì)胞中發(fā)揮促生存及遷徙受體功能。(2)在對多發(fā)性硬化模型研究中證實(shí)LRP1轉(zhuǎn)導(dǎo)信號可以吞噬降解的髓磷脂。(3)LRP1調(diào)節(jié)淀粉樣前蛋白的加工。(4)最近研究證實(shí)LRP1激動(dòng)劑在SFK依賴的通路中可以反式激活TrkA，促進(jìn)PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長[16-17]。

本研究為促進(jìn)軸突損傷后修復(fù)與再生提供了一個(gè)新的方向，并初步探討了其促進(jìn)軸突再生的分子機(jī)制。LDL基因家族受體的激動(dòng)劑,誘導(dǎo)Trk信號通路激活，導(dǎo)致ERK和Akt活化，結(jié)果明顯促進(jìn)神經(jīng)突的生長，并且鞘內(nèi)注射LRP1激動(dòng)劑后亦顯著促進(jìn)小鼠脊髓損傷后的功能修復(fù)。這些結(jié)果顯示脂蛋白受體靶點(diǎn)能激活與軸突相關(guān)的細(xì)胞信號通路。此外本研究中通過鞘內(nèi)注射LRP1激動(dòng)劑明顯促進(jìn)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，但是研究中使用的為條件性脊髓損傷，其與臨床病例相關(guān)但仍有其局限性。

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The activation of low density lipoprotein receptor related protein-1 dependent cell signaling pathway promotes axon growth and repair of nerve injury

Li Chao1,Ou Yangjia2,Zhu Jun1.

1North China University of Science and Technology,Tangshan 063009,China;2Faculty of Basic Medical Science Nanchang University,Nanchang 330031,China
Corresponding author:Zhu Jun,Email:zhujun@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of the low density lipoprotein receptors-1 (LRP1)dependent signal pathway in axonal growth and nerve regeneration after injury.MethodsAdding RBD,LRP1 agonist,when culture the cortical neurons of fetal rats,observing whether it can promote the growth of synapses and what the signal mechanism it is compared with the control group. In addition,observing the effects of RBD on the repair of nerve injury through building the spinal cord injury model of rats up and intrathecal inject the RBD.ResultsThe activation of neurotrophic factor receptor TrkC,Akt signal transduction pathway and extracellular regulated protein kinase(ERK) which were induced after add RBD in cortical neuron in vitro.The results of quantitative analysis of expression between the intervention group and the control group were significantly increased (P＜0.05),the growth of neurite were promoted.The recovery of motor function after spinal cord injury scores were significantly improved after the intrathecal injection of RBD in mice.ConclusionThe activation of signal pathway dependented by LRP1 can obviously promote the growth of axon and repair functions of rats after the spinal injury.

Low density lipoprotein receptor-related protein-1;Spinal cord injuries; Ethology;Wound healing

2015-03-13)

(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.02.010

063009唐山，華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院1；330031，南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2

朱軍，Email：zhujun@126.com

李超,歐陽佳,朱軍.激活低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1依賴的細(xì)胞信號通路可促進(jìn)軸突生長及神經(jīng)損傷修復(fù)[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(2)：95-99.