劉光杰 劉家傳 王金標(biāo) 楊艷艷 張星 王春琳 湯宏 徐燊

缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響

劉光杰 劉家傳 王金標(biāo) 楊艷艷 張星 王春琳 湯宏 徐燊

目的探討缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響。方法48只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照(Con)組、缺氧預(yù)處理(HPC)組、單純外傷(TBI)組和缺氧預(yù)處理顱腦外傷(HPCT)組。采用改良的Feeney’s自由落體裝置制作顱腦損傷大鼠模型，預(yù)先在低壓氧艙內(nèi)連續(xù)處理3 d(-50 kPa、3 h/d)制作缺氧預(yù)處理模型。采用HE染色法和新鮮標(biāo)本制作超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察各組大鼠皮層腦組織的大體結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。qRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)挫傷區(qū)周?chē)覶rxR2、CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果Con組和HPC組病理改變無(wú)明顯差異，HPCT組較TBI組大鼠病理改變輕，神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損明顯減輕。HPCT與TBI組比較，TrxR2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，CHOP mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)；Con與HPC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論缺氧預(yù)處理可明顯減輕顱腦外傷大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，這可能與上調(diào)TrxR2、下調(diào)CHOP的表達(dá)有密切關(guān)系，從而對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞起保護(hù)作用。

顱腦外傷；缺氧預(yù)處理；TrxR2；CHOP；超微結(jié)構(gòu)

顱腦外傷(traumatic brain injury，TBI)是腦組織遭受直接或間接打擊后伴隨一系列復(fù)雜變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明缺氧預(yù)處理(hypoxic preconditioning，HPC)對(duì)機(jī)體有明確的保護(hù)作用[2]，然而缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷的保護(hù)作用，前期實(shí)驗(yàn)雖已做了大量工作，但其病理改變及對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步闡述。線粒體硫氧還蛋白還原酶2(TrxR2)是線粒體中重要酶類(lèi)，具有抗氧化應(yīng)激能力，在顱腦外傷中對(duì)線粒體起重要保護(hù)作用[3]。生長(zhǎng)停滯DNA損害可誘導(dǎo)基因153(C/ EBP homologousprotein/growth arrest and DNA damage inducible gene153，CHOP/GADD153)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的經(jīng)典標(biāo)志物，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損時(shí)介導(dǎo)相關(guān)凋亡的發(fā)生，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立缺氧預(yù)處理與顱腦外傷大鼠模型，通過(guò)光鏡和電鏡下觀察腦組織病理改變，并檢測(cè)TrxR2和CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)變化，探討缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷后大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)器材和試劑

兔抗鼠TrxR2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗鼠CHOP抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，F(xiàn)eeney’s顱腦損傷打擊器(淮北正華生物科技公司)，低壓氧倉(cāng)(上海減壓器廠)，WDZ-2000微型磨鉆(上海晶杰醫(yī)療器械有限公司)，JEM-1230型透視電鏡(日本產(chǎn))，LKBNOVA型切片機(jī)(瑞典產(chǎn))，戊二醛(美國(guó)SPI公司)，環(huán)氧樹(shù)脂(美國(guó)SPI公司)，醋酸雙氧鈾(美國(guó)SPI公司)，檸檬酸鉛(北京達(dá)昱科儀公司)，環(huán)氧丙烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

48只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～230 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照(Con)組，缺氧預(yù)處理(HPC)組，單純外傷(TBI)組和缺氧預(yù)處理顱腦外傷(HPCT)組，共4組，每組12只，TBI和HPCT組大鼠于傷后24 h處死。

三、動(dòng)物模型制作和取材

缺氧預(yù)處理模型制作：將HPC組和HPCT組大鼠置于密封氧倉(cāng)內(nèi)，適應(yīng)后連接真空泵，勻速減壓至-50.47 kPa(設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)大氣壓為0 Pa，模擬5 500 m高度)，維持該壓力恒定訓(xùn)練3 h，然后緩慢恢復(fù)正常，出倉(cāng)。采用同樣方法連續(xù)訓(xùn)練3 d，其余組不進(jìn)行此處理。顱腦外傷模型制作經(jīng)腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉效果滿(mǎn)意后，固定于顱腦外傷打擊器，剪毛，消毒，延中線矢狀位切開(kāi)頭皮，暴露左頂骨骨膜，剝離骨膜，暴露顱骨，用微型磨鉆于前正中線左側(cè)旁開(kāi)3 mm，前囟門(mén)后3 mm處鉆一骨窗(直徑5 mm)，保持硬腦膜完整，將50 g砝碼固定于25 cm高處自由落體打擊骨窗，打擊完畢后，隨即做頭皮清創(chuàng)縫合術(shù)。僅對(duì)TBI和HPCT組進(jìn)行打擊。取挫傷區(qū)周?chē)迈r皮質(zhì)置于-80℃液氮罐中保存留做qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.HE染色：造模完成后各組分別取3只大鼠，經(jīng)麻醉，心臟灌注后，斷頭取腦，然后經(jīng)浸蠟包埋等步驟處理后，制備成5 μm石蠟切片，常規(guī)行蘇木素-伊紅(HE)染色，操作嚴(yán)格按照染色方法步驟進(jìn)行，光鏡下觀察并攝片。

2.神經(jīng)元細(xì)胞電鏡觀察：造模完成后各組分別取6只大鼠，經(jīng)麻醉，心臟灌注后，斷頭取腦，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液固定，取大小約1 mm3腦組織置于1 ml離心管內(nèi)，其余標(biāo)本置于液氮罐中保存，離心(2 000 r/min)10 min，固定于2.5%戊二醛中(4℃) 4～6h，隨后固定于1%鋨酸1h，30%、50%乙醇脫水各15 min，隨后置于70%醋酸鈾飽和液中浸泡6～12 h；80%、95%乙醇脫水各15 min，無(wú)水乙醇40 min，2次；濃度分別為1:1和1:2的環(huán)氧丙烷浸泡1 h和2 h；再浸泡環(huán)氧樹(shù)脂中2 h，用環(huán)氧樹(shù)脂包埋并置于45℃烤箱中12 h，增加烤箱溫度至65℃繼續(xù)烘烤48 h，取出包埋好的組織進(jìn)行超薄切片(片厚70 nm)，將切好的薄片置于醋酸鈾飽和水溶液中30 min，進(jìn)行雙蒸水洗15 min/次，3次；枸櫞酸鉛液中浸泡15 min，取出繼續(xù)雙蒸水洗15 min/次，3次；用JEM-1230型透射電鏡攝片觀察。

3.qRT-PCR檢測(cè)TrxR2、CHOP mRNA表達(dá)：取挫傷區(qū)周?chē)幽X組織100 mg，提取總mRNA，紫外分光光度計(jì)OD260 nm定量完成后，取8 μl按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取2 μl的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別加入10 μl含Taq酶及4種dNTP混合物，0.4 μl TrxR2引物序列上游：5’-GGCTTCCTCACTGGTATTGG-3’下游：5’-AGTTGGTTAGTCGGGAGTTTT-3’(或0.4 μl CHOP引物序列上游：5’-AGCAGAGGTCACAAGCACCT-3’，下游：5’-CTTCTCCTTCATGCGCTGTT-3’)；0.4μl β-actin引物序列上游：5’-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3’，下游：5’-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3’，7.2 μl雙蒸水共20 μl，充分混勻后置于PCR儀中，先95℃10 min預(yù)變性，然后依次經(jīng)95℃15 s、60℃60 s、72℃60 s，共循環(huán)40次，獲取TrxR2、CHOP和β-actin的Ct值，以β-actin為內(nèi)參，算出TrxR2、CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以2-△△Ct為指標(biāo)。

4.Western blotting法檢測(cè)TrxR2、CHOP蛋白表達(dá)：取挫傷區(qū)周?chē)?00 mg，嚴(yán)格按Western blotting實(shí)驗(yàn)步驟及抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，經(jīng)離心，留取上清，提取蛋白，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，滴加一、二抗免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，最后拍照。采用Quantity one4.6.2軟件分析各條帶積分灰度值，分別與β-actin蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比，表示目的蛋白TrxR2、CHOP的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPPS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，TrxR2、 CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、HE染色結(jié)果

光鏡下觀察，Con組與HPC組腦組織無(wú)明顯改變；HPCT組較TBI組腦組織損傷明顯減輕(圖1)。

二、神經(jīng)元細(xì)胞電鏡下改變

電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Con組：神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜完整，尼氏體存在，線粒體結(jié)構(gòu)完整、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；HPC組：神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與Con組基本相似；TBI組：神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)異常，尼氏體消失，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，基質(zhì)內(nèi)大量空泡變性，微細(xì)結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體嚴(yán)重受損、腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損嚴(yán)重；HPCT組：神經(jīng)元細(xì)胞損傷較TBI組輕，尼氏體可見(jiàn)，細(xì)胞輪廓存在，細(xì)胞膜基本完整，基質(zhì)內(nèi)少量空泡變性，微細(xì)結(jié)構(gòu)較完整，線粒體損傷輕、稍腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腫脹、擴(kuò)張(圖2)。

三、qRT-PCR檢測(cè)TrxR2、CHOP mRNA的結(jié)果

qRT-PCR結(jié)果顯示TrxR2、CHOP mRNA表達(dá)，Con組與HPC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；TBI與Con組，HPCT與HPC組比較，TrxR2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，CHOP mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其中，HPCT與TBI組比較，TrxR2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，CHOP mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1；圖3)。

四、TrxR2、CHOP蛋白的表達(dá)變化

圖1 各處理組大鼠HE染色(×400)

圖2 各組大鼠挫傷區(qū)周?chē)由窠?jīng)元細(xì)胞電鏡觀察(×1萬(wàn)倍)

TrxR2、CHOP蛋白的表達(dá)結(jié)果，Con組與HPC組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；TBI與Con組，HPCT與HPC組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HPCT與TBI組比，TrxR2蛋白表達(dá)上調(diào)，CHOP蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 TrxR2、CHOP蛋白電泳條帶

討論

顱腦外傷后腦組織損傷是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其復(fù)雜原因一方面由力生物學(xué)作用引起，另一方面則有繼發(fā)性應(yīng)激反應(yīng)引起[1]，涉及炎性應(yīng)激、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。外傷后引起的神經(jīng)元細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的改變以及繼發(fā)的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，嚴(yán)重影響細(xì)胞力傳導(dǎo)、信號(hào)傳導(dǎo)功能，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞微環(huán)境改變[2]。及時(shí)尋找一種能有效降低外傷后腦組織直接和間接應(yīng)激損傷的方法，對(duì)于恢復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞功能具有重要意義。缺氧預(yù)處理是指預(yù)先予以短暫的(3 h/d)、重復(fù)性(連續(xù)3 d)的缺氧訓(xùn)練，可顯著增強(qiáng)腦組織對(duì)隨后發(fā)生的缺氧、缺血等的耐受力[5]。盡管諸多研究已證實(shí)缺氧預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用，但其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響仍需更多證據(jù)。

神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是維持細(xì)胞正常生理功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子平衡等的重要前提[1]。其中最重要的是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定。線粒體是細(xì)胞氧化呼吸鏈的場(chǎng)所，TrxR2是線粒體中重要酶類(lèi)，參與線粒體的氧化應(yīng)激，提高缺氧等狀態(tài)下線粒體提供ATP能力[3,6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工、合成、鈣離子儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所，當(dāng)缺血缺氧、能量匱乏等條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能被打破，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)反應(yīng)，CHOP是ERS經(jīng)典標(biāo)志物之一，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能?chē)?yán)重受損時(shí)表達(dá)上調(diào)[4,7]。

表1 各組大鼠皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白表達(dá)(n=6

表1 各組大鼠皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白表達(dá)(n=6

注：aP＜0.05：TBI與Con組，HPCT與HPC組比較；bP＜0.05：與TBI組比較。

分組Con組HPC組TBI組HPCT組F值P值鼠數(shù)(例) 12 12 12 12 TrxR2CHOP mRNA 1.01±0.01 1.02±0.01 3.92±0.12a4.03±0.14ab2136.000 0.000蛋白0.19±0.00 0.19±0.00 0.73±0.01a0.78±0.03ab2129.000 0.000 mRNA 0.42±0.08 0.38±0.08 1.02±0.01a0.95±0.02ab220.500 0.000蛋白0.35±0.01 0.35±0.01 0.67±0.01a0.66±0.01ab2209.000 0.000

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過(guò)HE染色和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HPC與Con組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均無(wú)異常。TBI組與HPCT組，光鏡下腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；電鏡下神經(jīng)元細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器受損嚴(yán)重；然而，HPCT組與TBI組比較，腦組織受損較輕，神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)具有較好的完整性。這與Liu等[8]缺氧預(yù)處理可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)相一致。傷后24 h挫傷區(qū)周?chē)覶rxR2、CHOP mRNA和蛋白表達(dá)，Con與HPC組無(wú)明顯差異，HPCT組較TBI組TrxR2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，CHOP mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示缺氧預(yù)處理可顯著誘導(dǎo)顱腦外傷大鼠TrxR2 mRNA和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)線粒體抗氧化應(yīng)激能力，降低線粒體損傷；同時(shí)，下調(diào)CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性損傷。提示缺氧預(yù)處理可顯著增強(qiáng)外傷后神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，這與Galle等[9]的實(shí)驗(yàn)研究，缺氧預(yù)處理對(duì)缺氧缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用一致。然而，Liamina等[10]還提出，機(jī)體對(duì)缺氧、缺血的適應(yīng)若更好的服務(wù)于臨床，須提供更多有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部耐受機(jī)制的證據(jù)。

綜上所述，缺氧預(yù)處理可顯著減輕顱腦外傷大鼠病理?yè)p傷，較好的保持線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的完整性，這可能與上調(diào)TrxR2，同時(shí)下調(diào)CHOP的表達(dá)密切相關(guān)，降低線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器損傷，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞功能恢復(fù)。然而對(duì)于功能較難恢復(fù)的細(xì)胞，最終將走向凋亡或死亡。缺氧預(yù)處理對(duì)這部分細(xì)胞的作用如何，也將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

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Effects of hypoxic preconditioning on cortical expression of TrxR2 and CHOP of rats with craniocerebral injury and ultramicrostructural changes of neurons

Liu Guangjie, Liu Jiachuan,Wang Jinbiao,Yang Yanyan,Zhang Xing,Wang Chunlin,Tang Hong,Xu shen.
Department of Neurosurgery,the No.105 Hospital of PLA,Hefei 230031,China

Liu Jiachuan,Email:ljc571017@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxic preconditioning on the expression of TrxR2、CHOP and the ultra-structure of the neuronal cells of rats suffered traumatic brain injury.MethodsForty eight Sprague Dawley rats were randomly divided into control group(Con),hypoxic preconditioning group(HPC),traumatic brain injury group(TBI)and hypoxic preconditioning traumatic brain injury group(HPCT).The traumatic brain injury model of rats were made by the Feeney’s improved equipment and hypoxic preconditioning model were made by Hypobaric chamber for successive 3 days(-50 kPa、3 h/d).Staining HE and making ultra-thin slicing by fresh specimen to observe the potential change of general structure and ultra-structure of rats’brain tissue of each group respectively under light microscope and electron microscope.Expressions of TrxR2、CHOP mRNA and proteins were detected in the brain cortex around the contusion area by qRT-PCR and Western blotting.ResultsThe pathologic change has no difference between Con gourp and HPC group.HPCT group has a lighter pathologic change than the TBI group.The expressions of TrxR2 mRNA and protein was significantly higher in the brain cortex in the HPCT group than the TBI group,the difference between the two group was significant(P＜0.05),the expressions of CHOP mRNA and protein was significantlylower in the brain cortex in the HPCT group than the TBI group,the difference between the two group was significant(P＜0.05),while the difference between the Con group and the HPC group was not significant(P＞0.05).ConclusionHypoxia preconditioning can obviously reduce the craniocerebral trauma rats cortex neuron cell morphology change,which has a close relationship with the upregulated expression of TrxR2 and the downregulated expression of CHOP,in order to protection of neurons.

Traumatic brain injury;Hypoxic preconditioning;TrxR2;CHOP; Ultra-structure

2015-04-25)
(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.03.010

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研面上項(xiàng)目(編號(hào)：CWS11J262)；2009年度南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新重點(diǎn)課題(編號(hào)：09Z009)

230031合肥，解放軍第105醫(yī)院神經(jīng)外科

劉家傳，Email：ljc571017@sina.com

劉光杰,劉家傳,王金標(biāo),等.缺氧預(yù)處理對(duì)顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達(dá)及神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(3):164-168.