鄧春青 馮珊珊

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)1992年的血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示：國(guó)內(nèi)一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性率為9.75%[1]，屬于HBV感染的高流行區(qū)。HBV感染后容易慢性化，與肝硬化和肝癌的發(fā)生顯著相關(guān)，部分還可轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦透窝譡2]。目前在HBV感染的遺傳易感性研究中，疾病關(guān)聯(lián)研究最常用。筆者進(jìn)行HBV感染候選基因的關(guān)聯(lián)研究所需的大樣本量較歐、美等發(fā)達(dá)地區(qū)更具優(yōu)勢(shì)。關(guān)鍵之處則在于將收集的大量樣本抽提出DNA并制備成分型所用96孔模板，這無(wú)疑是進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)研究的基礎(chǔ)和前提。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象選擇本院傳染科門(mén)診及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地區(qū)漢族居民，靜脈抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血：5 mL用于基因組DNA提?。? mL用于病毒標(biāo)志和生化檢測(cè)；同時(shí)填寫(xiě)詳細(xì)的臨床資料并輸入計(jì)算機(jī)。樣本收集過(guò)程按照國(guó)家人類(lèi)基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行，獲得了收集對(duì)象的知情同意。乙型肝炎依據(jù)2000年西安第十次全國(guó)病毒性肝炎會(huì)議修訂“病毒性肝炎防治方案”制定標(biāo)準(zhǔn)診斷[3]，另外筆者收集了部分血站獻(xiàn)血員作為正常對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 人白細(xì)胞基因組DNA提取 采用Miller鹽析法[4]進(jìn)行。（1）EDTA-K2抗凝全血5 mL，置于50 mL有蓋圓底離心管內(nèi)。（2）加6~8倍體積（約35~40 mL）蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，于4 ℃ 5000 g離心20 min。（3）傾倒上清后于沉淀中加入預(yù)冷的0.1%Triton-X100（約35~40 mL），輕柔混勻沉淀，再次于4 ℃ 5000 g離心20 min，然后棄上清。（4）加入2 mL裂解液于沉淀中，徹底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μL至終濃度為0.5%，混勻。（5）加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至終濃度為200 μg/mL，混勻，于55 ℃4 h或37 ℃過(guò)夜消化。（6）加入6.0M NaCl液0.7 mL，劇烈振蕩20 s。（7）7000 g離心20 min，將上清移至50 mL有蓋圓底離心管內(nèi)。（8）加入2倍體積-20 ℃無(wú)水乙醇或95%乙醇，反復(fù)顛倒混勻，直至出現(xiàn)絮狀沉淀，挑出DNA至一eppendorf管中。（9）1 mL 75%乙醇洗滌DNA兩遍。自然晾干，用200 μL TE溶解DNA（4 ℃需要3~7 d）。（10）75%乙醇中的DNA離心，棄上清。（11）凝膠電泳確定所提DNA，UV計(jì)測(cè)定純度和濃度，于TE中-20 ℃凍存。

1.2.2 模板的制備 （1）將所抽提的DNA樣本定量后加水稀釋至終濃度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。（2）每個(gè)96孔PCR板的最后2孔設(shè)為空白對(duì)照不加DNA樣本。（3）用鋁箔膠帶封口。（4）于Eppendorf Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)中離心5 min。（5）置-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

歷時(shí)將近兩年，去除因各種原因資料不全以及極少數(shù)抽提DNA不理想的樣本，共收集到2561份DNA標(biāo)本，全部制備成96孔模板。其中，男1940例，女621例，年齡21~75歲。

收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎（AHB）15例，乙肝病毒攜帶者（AsC）279例，慢性乙型病毒性肝炎（CHB）1497例，肝癌（HCC）23例，肝硬化（LC）218例，重型乙型病毒性肝炎（SHB）168例，自身免疫性肝炎（AIH）15例，慢性丙型病毒性肝炎（CHC）16例，原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）5例，其他原因所致疾?。∣thers）104例，同時(shí)收集正常獻(xiàn)血員（BD）221例，詳細(xì)患者臨床資料見(jiàn)表1。

表1 所選患者臨床資料

圖1 全血基因組DNA

圖2 鋁箔膠帶封口96孔模板

3 討論

乙型肝炎呈世界性流行，不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌。因此，它已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性疾病，也是我國(guó)當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。本試驗(yàn)所收集到的HBV感染病例中，急性感染者僅占0.68%（15/2200），其余分別表現(xiàn)為慢性肝炎、乙型肝炎病毒攜帶、肝硬化甚至肝癌等慢性HBV感染狀態(tài)。當(dāng)然，除歸結(jié)于諸多隱性HBV感染外[6]，HBV感染所致較高慢性化程度的本質(zhì)也暴露無(wú)疑。筆者收集的病例包括乙肝病毒攜帶者、急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等HBV感染所致的所有疾病譜。而且在收治的所有肝病中，確診有HBV感染的占94.02%（2200/2340），再一次強(qiáng)勢(shì)表明HBV感染仍是今后較長(zhǎng)時(shí)期面臨的主要疾病[5]，因而有關(guān)HBV感染的研究也將任重而道遠(yuǎn)。此外，自身免疫性肝病作為一種發(fā)病機(jī)理不明的疾病與許多疾病有關(guān)聯(lián)，且由于最初的臨床癥狀與病毒性肝炎癥狀相似，臨床上診斷比較困難。因此，準(zhǔn)確及時(shí)地監(jiān)測(cè)出自身免疫性肝病的特異性自身抗體無(wú)疑對(duì)診斷以及進(jìn)一步治療具有重要意義。臨床上最典型的自身免疫性肝病包括：原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）和自身免疫性肝炎（AIH）。隨著檢測(cè)水平的不斷提高和檢測(cè)手段的日趨完善，原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎等諸多自身免疫性肝病的診斷一定會(huì)愈來(lái)愈受到重視。

以生物學(xué)功能相關(guān)的基因作為候選基因進(jìn)行疾病關(guān)聯(lián)研究，是當(dāng)前宿主遺傳易感性研究的主要策略。關(guān)聯(lián)研究是一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的分析技術(shù)，就是發(fā)現(xiàn)存在于大量數(shù)據(jù)集中的關(guān)聯(lián)性或相關(guān)性，從而描述了一個(gè)事物中某些屬性同時(shí)出現(xiàn)的規(guī)律和模式。關(guān)聯(lián)研究不必知道疾病的遺傳模式、表現(xiàn)型比率、不完全外顯率、遺傳異質(zhì)性等，便于設(shè)計(jì)及開(kāi)展，而且大量樣本可產(chǎn)生重復(fù)性良好的結(jié)果。關(guān)聯(lián)研究最重要的是應(yīng)該避免因群體混雜或分層而出現(xiàn)的虛假的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)結(jié)果，為避免這種情況的發(fā)生，可采取一些措施：臨床分型詳細(xì)、適當(dāng)；病例和對(duì)照應(yīng)受相同病因作用，排除疾病異質(zhì)性；樣本量足夠大；病例/對(duì)照性別、年齡匹配。本試驗(yàn)中筆者所收集到的樣本量足夠大，病例和對(duì)照人群來(lái)自太原地區(qū)，病例與對(duì)照之間的年齡、性別基本匹配，臨床分型嚴(yán)格按照西安全國(guó)肝病會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，保證了進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究的需要。

由于分散性的進(jìn)行樣本收集，筆者采取了一定的策略：零星收集標(biāo)本后凍存，然后集中進(jìn)行提取。收集標(biāo)本的同時(shí)填寫(xiě)詳盡的臨床學(xué)資料并錄入電腦，這樣排除了樣本重復(fù)的可能。筆者還將患者既往情況、既往住院病歷從信息科一一調(diào)出核查證實(shí)以確保詳實(shí)地反映患者的疾病狀況尤其是HBV感染狀態(tài)、肝臟功能等，另外，筆者收集標(biāo)本、抽提DNA以及制作模板的過(guò)程當(dāng)中，完全按所收集標(biāo)本時(shí)間的先后順序依次完成，始終未將患者的診斷考慮在內(nèi)，從而保證了樣本的隨機(jī)性。

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于100~200 kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。電泳鑒定提取的DNA如果不成區(qū)帶，而是散開(kāi)，則說(shuō)明DNA已經(jīng)被降解成小分子，不能再用來(lái)進(jìn)行限制性酶切等基因研究。本試驗(yàn)所抽提人基因組DNA成完整區(qū)帶，濃度較高、純度較好、質(zhì)量相當(dāng)穩(wěn)定，證實(shí)靜脈血仍然是提取基因組DNA的最佳標(biāo)本[7]。商業(yè)化DNA抽提試劑盒以及既往傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提法均需要分離外周血白細(xì)胞[8-9]，無(wú)法有效提取凍存血樣；實(shí)際操作可行性小，以試劑盒提取大樣本量的DNA花費(fèi)過(guò)高，對(duì)筆者所收集的如此龐大的病例標(biāo)本來(lái)說(shuō)無(wú)疑代價(jià)高昂。在初始采用鹽析法提取凍存全血基因組的過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)37 ℃過(guò)夜消化或加入蛋白酶K后于55 ℃消化4 h兩者之間所提取的DNA有較大差別。無(wú)論所提取DNA的濃度、質(zhì)量或者穩(wěn)定性，經(jīng)37 ℃過(guò)夜消化后均明顯優(yōu)于55 ℃消化4 h。故此筆者之后基本采取了加入蛋白酶K后于37 ℃過(guò)夜消化的方法。總而言之，采用鹽析法提取凍存全血基因組DNA方便、經(jīng)濟(jì)，所提DNA質(zhì)量穩(wěn)定，UV計(jì)測(cè)定純度和濃度后顯示足以滿足PCR擴(kuò)增的需要。以此模板庫(kù)為基礎(chǔ)，誕生了許多重要的研究[10-15]。

[1] Chu C J，Lok A S.Clinical significance of hepatitis B virus genotypes[J].Hepatology（Baltimore，Md.），2002，35（5）：1274-1276.

[2]莊輝.流行病學(xué)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：721-738.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì).中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C].西安，2000.

[4] Miller S A，Dykes D D，Polesky H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J].Nucleic Acids Research，1988，16（3）：1215.

[5] Revill P，Yuan Z.New insights into how HBV manipulates the innate immune response to establish acute and persistent infection[J].Antiviral Therapy，2013，18（1）：11-15.

[6] Allain J，Mihaljevic I，Gonzalez-Fraile M I，et al.Infectivity of blood products from donors with occult hepatitis B virus infection[J].Transfusion，2013，53（7）：1405-1415.

[7]范海榮，夏永靜，孫福成，等.四種全血基因組DNA提取方法的比較[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2002，10（6）：535-536.

[8]盧圣棟主編.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].第2版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：677.

[9]秦斌.四氫葉酸還原酶基因C677T突變與阿爾茨海默病有關(guān)[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2002，9（4）：230-234.

[10] Yan Z，Tan S，Dan Y，et al.Relationship between HLA-DP gene polymorphisms and clearance of chronic hepatitis B virus infections：case-control study and meta-analysis[J].Infect Genet Evol，2012，12（6）：1222-1228.

[11] Deng C Q，Deng G H，Wang Y M.HMGB1 gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].World Journal of Gastroenterology，2013，19（31）：5144-5149.

[12] Yan Z，Tan W，Dan Y，et al.Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and risk of HBV-related acute liver failure in the Chinese population[J].BMC Med Genet，2012，13（7）：49.

[13]王丹，鄧春青，趙龍鳳.HMGB1基因多態(tài)性與HBV相關(guān)性肝癌的關(guān)聯(lián)性研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（12）：13-15.

[14]劉蒙，趙龍鳳.維生素D受體基因多態(tài)性與慢性乙型肝炎患者的關(guān)聯(lián)研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（12）：22-24.

[15]羅昊翔，冉光鑫.乙型肝炎病毒父嬰傳播易感因素與預(yù)防[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（6）：138-139.