匡重伸 許航 黃征 朱桂云 王勝

鈣蛋白酶（calpain）廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，對調(diào)控人體正常的生理功能起著重要的作用[1]。屬于半胱氨酸蛋白酶超家族中番木瓜蛋白酶家族成員。正常情況下，calpain以無活性的酶原形式存在于休止期細(xì)胞中，腦缺血后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載而激活，激活后的calpain可通過多種途徑導(dǎo)致缺血性腦損傷。隨著對缺血性腦損傷分子機(jī)制的深入了解，發(fā)現(xiàn)calpain在缺血性腦損傷中起著重要作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動脈栓塞實(shí)驗(yàn)動物模型及側(cè)腦室注射技術(shù)，研究calpain抑制劑calpeptin對缺血再灌注后不同時(shí)相大鼠神經(jīng)功能評分、缺血側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及腦梗死體積，探討calpain抑制劑在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠144只，體重250~280 g，由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為四組，每組36只：缺血/再灌注對照組（MACO組），calpeptin治療組（calpeptin組），溶劑二甲基亞砜對照組（DMSO組），假手術(shù)組（sham組）。每組又分為再灌注后12、24和48 h三小組，每組12只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取6只大鼠行TTC染色檢測腦梗死體積，6只檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。Calpeptin及DMSO購至calbiochem公司，TUNEL試劑盒購至博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 手術(shù)前大鼠用1%的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，暴露前囟，調(diào)節(jié)微調(diào)旋鈕，使微量注射器針尖正對左側(cè)側(cè)腦室（前囟左側(cè)1.8 mm，后0.8 mm），鉆孔，將微量注射器下移至軟腦膜，緩慢進(jìn)針4.5 mm，注射calpeptin 50 μg（溶于DMSO 5 μL中）或DMSO 5 μL，注射時(shí)間5 min，留針5 min，注射后即進(jìn)行造模手術(shù)。

1.2.2 MCAO模型的建立 參照Belayev等[3]改良的Longa方法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型，假手術(shù)組尼龍線插入的深度為10 mm，其余步驟相同。手術(shù)期間用100 W的白熾燈照射，保持大鼠肛溫在36.5~37.5 ℃。2 h后小心拉出尼龍線10 mm即造成再灌注模型，再次扎緊CCA及其內(nèi)的尼龍線。

1.2.3 神經(jīng)功能評價(jià) 大鼠麻醉清醒后，參考Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對其進(jìn)行神經(jīng)功能評定，0分：無神經(jīng)損傷體征；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失[4]。分值越高說明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

1.2.4 TTC染色測量腦梗死體積 神經(jīng)功能行為評價(jià)完成后，動物麻醉后斷頭處死，迅速取腦，生理鹽水沖洗殘血，置0 ℃生理鹽水中15 min，再取出置于大鼠腦墊中，去掉鼠腦嗅球、小腦和部分低位腦干，剩余部分由前向后行2 mm厚冠狀切片，迅速放入2%TTC溶液中，37 ℃恒溫孵育30 min，染色后置10%甲醛中固定。24 h后取出用數(shù)碼相機(jī)拍照腦片兩面，輸入計(jì)算機(jī)，用多功能真彩色病理圖像分析儀及計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀測量腦片兩個(gè)面的梗死面積（玫瑰紅色區(qū)為正常腦組織，蒼白色區(qū)為梗死區(qū)），根據(jù)梯形法計(jì)算出梗死灶體積，各腦片梗死體積之為總的梗死體積。同時(shí)計(jì)算出每個(gè)腦片的體積，每個(gè)腦片的體積之和為整個(gè)腦體積，梗死體積和腦體積之比為梗死體積百分比。

1.2.5 原位細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL法） 實(shí)驗(yàn)動物在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評分后經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，依次用4 ℃生理鹽水200 mL及4 ℃ 4%多聚甲醛400 mL經(jīng)左心室升主動脈灌注，灌注完立即斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中后固定10 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋，在海馬與齒狀回互抱處取材，每隔100 μm連續(xù)6 μm切片6張，切片貼附于預(yù)處理的載玻片上，用前脫蠟至水。用TUNEL技術(shù)檢測大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡，具體操作方法按說明書進(jìn)行。在高倍鏡（×400）下觀察海馬CA1區(qū)中相互不重疊的4個(gè)視野，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。每一批實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性對照和陰性對照。陽性對照為在TUNEL標(biāo)記反應(yīng)前用DNaseⅠ（1 mg/mL）37 ℃溫箱孵育切片20 min，結(jié)果細(xì)胞核呈陽性。陰性對照為TUNEL標(biāo)記反應(yīng)液中省去TUNEL反應(yīng)混合液，而只加標(biāo)記液，結(jié)果細(xì)胞不顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分 sham組大鼠蘇醒后未見明顯的神經(jīng)功能學(xué)缺失，MCAO組麻醉蘇醒后即有明顯的神經(jīng)功能缺失，再灌注24 h神經(jīng)功能缺失最為嚴(yán)重。DMSO組與MCAO對照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各時(shí)間點(diǎn)的calpeptin處理組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組相比神經(jīng)功能有明顯改善，但仍高于sham組。見表1。

表1 各組大鼠不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評分比較（x-±s） 分

2.2 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡 TUNEL技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，sham組有少量的神經(jīng)元凋亡，MCAO組在缺血2 h再灌注12 h即可檢測到明顯的神經(jīng)元凋亡，在24 h達(dá)高峰，DMSO組與同時(shí)間點(diǎn)的MCAO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各時(shí)間點(diǎn)calpeptin組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組比較，凋亡的神經(jīng)元顯著減少。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)海馬CAN1區(qū)神經(jīng)元凋亡比較（x-±s）

2.3 腦梗死體積 sham組未見明顯的梗死灶，MCAO組可見比較恒定的白色梗死區(qū)，梗死部位主要集中在額頂區(qū)皮質(zhì)、尾殼核背外側(cè)。DMSO組與同時(shí)間點(diǎn)的MCAO組相比梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各再灌注時(shí)間點(diǎn)calpeptin處理組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組相比，梗死體積顯著減小。見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積比較（x-±s）

3 討論

缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，其病理生理過程涉及多種毒性級聯(lián)過程[5]。calpain在缺血性腦損傷中起著重要的作用而備受關(guān)注，是近年來研究的熱點(diǎn)之一[6]。calpain分為calpainⅠ（又稱μ-calpain）和calpainⅡ（又稱m-calpain）兩種類型，可分別被微摩爾和毫摩爾水平的Ca2+激活[7]，在生理狀態(tài)下，calpain以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[8]，在病理情況下（如腦缺血等），細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，Ca2+與calpain催化區(qū)的特異性鈣調(diào)蛋白樣位點(diǎn)結(jié)合引起構(gòu)象改變，從而使其激活，激活后的calpain可水解關(guān)鍵的細(xì)胞骨架蛋白而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn)猴子短暫性全腦缺血后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)μ-calpain大量激活，激活后的μ-calpain可水解溶酶體膜連接蛋白，導(dǎo)致溶酶體破裂，導(dǎo)致水解酶大量釋放，造成神經(jīng)元壞死[10]。激活后的calpain還可引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

以往一直認(rèn)為calpain主要參與細(xì)胞壞死，但越來越多的證據(jù)表明它也在凋亡中也起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑PD1506可顯著抑制培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及海馬神經(jīng)元的凋亡，說明calpain參與了神經(jīng)元的凋亡的發(fā)生[11]。

本研究通過檢測腦梗死體積、神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)功能評分3項(xiàng)指標(biāo)，顯示側(cè)腦室注射calpeptin可顯著減少M(fèi)CAO術(shù)后大鼠腦梗死體積及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，并可改善大鼠的神經(jīng)功能。進(jìn)一步證實(shí)calpain抑制劑對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有顯著的腦保護(hù)作用，并且calpeptin抑制腦缺血后神經(jīng)元凋亡可能是其腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。calpain參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡的機(jī)制目前尚不很清楚，目前認(rèn)為其可能的機(jī)制有：（1）促進(jìn)caspase-3激活從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]；（2）可激活促凋亡蛋白bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]；（3）引起bax/bcl-2的比率增高[14]；（4）calpain還可能參與細(xì)胞凋亡過程中的DNA的階梯性裂解及染色體的聚集[15]。本實(shí)驗(yàn)中calpeptin是通過何種途徑抑制缺血后海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究。腦缺血損傷機(jī)制復(fù)雜，在過去的十年，國內(nèi)外學(xué)者在關(guān)于calpain在腦缺損傷中的作用機(jī)制方面進(jìn)行了大量的研究，有學(xué)者認(rèn)為，calpain將成為治療腦損傷的一個(gè)重要靶點(diǎn)，研究開發(fā)新型的、副作用小、特異性強(qiáng)的calpain抑制劑，并用于人類臨床治療中，將為腦缺血治療帶來新的希望。

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