趙建華, 李浩霞, 尹 躍, 安 巍, 王華芳, 王亞軍, 石志剛

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院/國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002; 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,寧夏銀川 750002)

枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達(dá)

趙建華1,2, 李浩霞3, 尹 躍2, 安 巍2, 王華芳1, 王亞軍2, 石志剛2

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院/國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心,寧夏銀川 750002; 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,寧夏銀川 750002)

以枸杞果實(shí)為試驗(yàn)材料,利用RACE技術(shù)克隆枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因LbAI的全長(zhǎng)cDNA序列,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析LbAI預(yù)期編碼蛋白質(zhì)特征;采用氣相色譜法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)及不同顏色成熟果實(shí)中可溶性糖含量及LbAI在果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:LbAI的cDNA序列全長(zhǎng)2 252 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 920 bp,編碼642個(gè)氨基酸,LbAI編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量和等電點(diǎn)(pI)分別為70 600和5.9,GenBank登錄號(hào)為KM191309。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,枸杞與馬鈴薯和番茄的親緣關(guān)系最近,相似性在85%以上。隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育,枸杞果實(shí)中果糖和葡萄糖含量不斷升高,而蔗糖呈現(xiàn)出降低趨勢(shì);不同顏色枸杞果實(shí)中糖含量差異較大,成熟紅色和黃色果實(shí)中果糖和葡萄糖含量顯著高于黑色果實(shí),但蔗糖含量在黑色果實(shí)中最高,在紅色果實(shí)中最低;LbAI相對(duì)表達(dá)與果實(shí)中葡萄糖含量變化基本一致。表明LbAI基因在枸杞果實(shí)糖積累過(guò)程中具有重要的作用。

枸杞;酸性轉(zhuǎn)化酶;基因克隆;表達(dá);可溶性糖

枸杞為茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生落葉灌木,具有很強(qiáng)的抗逆性,是改良鹽堿地的先鋒樹(shù)種[1-3],其果實(shí)中含有豐富的糖類物質(zhì)[4]。糖是果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的主要成分,也是色素、氨基酸、維生素和芳香物質(zhì)等其他營(yíng)養(yǎng)成分合成的基礎(chǔ)原料,還參于新陳代謝和能量供給,并在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著信號(hào)分子的作用[5-6]。轉(zhuǎn)化酶是調(diào)節(jié)蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一,在枸杞糖積累過(guò)程中發(fā)揮著主要作用[7-8]。因此,克隆枸杞轉(zhuǎn)化酶基因,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)特性分析,進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化酶在枸杞果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖積累的作用具有重要意義。

轉(zhuǎn)化酶廣泛存在于高等植物中,不同組織存在著多種轉(zhuǎn)化酶同工酶形式,主要包括酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和堿性或中性轉(zhuǎn)化酶(NI)。酸性轉(zhuǎn)化酶可分為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和不可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶[9-10]。可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶主要存在于液泡中,其活性升高常與植物幼嫩組織的快速生長(zhǎng)、貯藏器官的迅速膨大相關(guān),其機(jī)理可能是蔗糖被AI分解為果糖和葡萄糖,導(dǎo)致液泡滲透壓升高,從而誘導(dǎo)液泡生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂[11-12]。AI酶活性的缺乏是蔗糖積累的先決條件,酶活性高于臨界閥值時(shí)將不再積累高濃度的蔗糖,主要起分解蔗糖作用[13]。枸杞果實(shí)轉(zhuǎn)色前后枸杞果實(shí)中AI活性明顯升高,糖的積累以葡萄糖和果糖為主[14],在成熟寧夏枸杞果實(shí)中,葡萄糖和果糖含量與AI和NI均呈極顯著正相關(guān),糖積累也以果糖和葡萄糖為主,且蔗糖含量很低[7,15]。王麗娟等[16]以寧夏枸杞為試驗(yàn)材料,克隆得到了枸杞可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(SAI)的全長(zhǎng),并發(fā)現(xiàn)該基因在枸杞花中表達(dá)量最高,在根中表達(dá)水平較低。有關(guān)枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶(LbAI)分子水平研究相對(duì)滯后,克隆的枸杞SAI基因在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)與糖含量的關(guān)系及其參與果實(shí)糖積累的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究采用RACE-PCR技術(shù)克隆枸杞AI的cDNA全長(zhǎng),并用生物信息學(xué)分析該基因的序列特征。在此基礎(chǔ)上,利用GC法和qRT-PCR技術(shù)分別對(duì)不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)中糖含量及LbAI相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定分析,以期為枸杞果實(shí)糖積累的分子機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)以國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心枸杞種質(zhì)資源圃保存的寧杞1號(hào)、黃果枸杞和黑果枸杞十年生枸杞樹(shù)為材料。采集寧杞1號(hào)開(kāi)花后9 d、15 d、22 d、27 d和34 d的果實(shí),黃果枸杞和黑果枸杞采集成熟果實(shí),并分別進(jìn)行糖含量測(cè)定和熒光定量分析。所有供試材料采樣后迅速置于液氮中,在-80℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用Trizol提取液提取寧杞1號(hào)成熟果實(shí)中總RNA,提取過(guò)程參照Trizol試劑盒(天根生化科技有限公司產(chǎn)品)說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成使用試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit& DNase I(Thermo Scientific公司產(chǎn)品)完成。

1.2.2 目的基因中間片段克隆 根據(jù)NCBI公布的茄科植物(馬鈴薯、番茄、煙草等)酸性轉(zhuǎn)化酶基因保守區(qū)的核苷酸序列,運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)兼并引物F1和R1(表1)。PCR擴(kuò)增體系(50.0 μl),包括10×PCR bufferEx Taq5.0 μl、dNTP(2 mmol/L)5.0 μl、上下游引物各(10 μmol/L)2.0 μl、模板cDNA 1.0 μl、Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl、dd H2O 34.5 μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s,60℃退火30 s,68℃延伸1 min 30 s, 30個(gè)循環(huán);68℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞上,挑選陽(yáng)性克隆送到華大基因測(cè)序。

1.2.3 目的基因5′端序列克隆 根據(jù)克隆出中間片段,設(shè)計(jì)引物GSP1、GSP2和GSP3(表1)。采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Version 2.0)試劑盒進(jìn)行目的基因的5′端序列克隆。使用SUPERSCRIPTⅡRT酶和引物GSP1對(duì)總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成,用RNase Mix對(duì)合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理,使用DNA純化系統(tǒng)對(duì)經(jīng)RNAase處理過(guò)的cDNA進(jìn)行純化,然后,用TdT酶和dCTP對(duì)純化后的cDNA進(jìn)行末端加上多聚C(dC)。以引物GSP2和試劑盒里自帶的橋連鉚釘引物AAP對(duì)已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增,擴(kuò)增體系(50.0 μl),包括ddH2O 31.5 μl、10×PCR buffer 5.0 μl、MgCl2(25 mmol/L)3.0 μl、dNTP(10 mmol/L) 1.0 μl、GSP2(10 μmol/L)2.0 μl、Abridged Anchor Primer(10 μmol/L)2.0 μl、dC-tailed cDNA 5.0 μl、DNA聚合酶(5 U/μl)0.5 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min;94℃變性為1 min,55℃退火45 s,72℃延伸1.2 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。取出第一輪PCR產(chǎn)物5 μl,用引物GSP3和試劑盒里自帶的通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增,擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min;94℃變性為1 min,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min,5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞上,挑選陽(yáng)性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 目的基因3′端序列克隆 根據(jù)克隆出的中間片段,設(shè)計(jì)引物3′461-1和3′461-2(表1)。采用Clontech公司生產(chǎn)的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進(jìn)行目的基因的3′端序列克隆。使用逆轉(zhuǎn)錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3′CDS primer A對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以引物3′461-1和UPM,對(duì)合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系(50 μl),包括ddH2O 31.0 μl、10×Advantage 2 PCR buffer 5.0 μl、50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μl、dNTP(10 mmol/L)1.0 μl、3′461-1引物(10 μmol/L)2.0 μl、UPM引物(10X)5.0 μl、cDNA 5.0 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性4 min;94℃30 s,72℃3 min,5個(gè)循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,72℃3 min, 5個(gè)循環(huán);94℃30 s,68℃30 s,72℃3 min,27個(gè)循環(huán)。將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后,用引物3′461-2和UPM進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性4 min;94℃30 s,72℃3 min,5個(gè)循環(huán);94℃30 s,70℃30 s,72℃3 min,5個(gè)循環(huán); 94℃30 s,68℃30 s,72℃3 min,27個(gè)循環(huán),5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞上,挑選陽(yáng)性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 全長(zhǎng)cDNA拼接驗(yàn)證 運(yùn)用ContigExpress軟件對(duì)酸性轉(zhuǎn)化酶基因的中間片段、5′片段、3′片段進(jìn)行拼接,利用NCBI網(wǎng)站上Open Reading Frame Finder軟件對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行編碼區(qū)分析。在編碼區(qū)序列兩端設(shè)計(jì)1對(duì)引物F2和R2(表1),對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。擴(kuò)增體系(50.0 μl):包括10×PCR bufferEx Taq5.0 μl、dNTP(2 mmol/L)5.0 μl、引物各(10 μmol/L)2.0 μl、模板cDNA 1.0 μl、Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl、ddH2O 34.5 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性4 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃3min,35個(gè)循環(huán);72℃10 min,5℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與載體pMD18T(TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接,然后轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞上,挑選陽(yáng)性克隆送到深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用網(wǎng)站(http:// www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)分析LbAI基因所編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量,并利用DNAStar軟件生成LbAI氨基酸序列進(jìn)化樹(shù),分析其進(jìn)化關(guān)系。利用MEGA5.0軟件進(jìn)行基因氨基酸序列同源性比較。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析 根據(jù)LbAI的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物F3和R3(表1),以枸杞18S基因作為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)引物18S-F和18S-R (表1)。不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)和不同顏色枸杞果實(shí)RNA提取第一鏈cDNA的合成按照方法1.2.1進(jìn)行,采用BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn),使用Power SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems?)試劑,反應(yīng)體系為2×SYBR PCR Mix 10.0 μl、正反向引物各0.5 μl、cDNA 0.5 μl,加水至20.0 μl,每個(gè)樣品設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min;95℃10 s,55℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán);65℃開(kāi)始以1 s 0.5℃逐步升溫至95℃。反應(yīng)完成后進(jìn)行溶解曲線分析,參照2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 可溶性糖測(cè)定 參照Z(yǔ)hao等[4]方法,用氣相色譜法測(cè)定枸杞果實(shí)中的可溶性糖含量。采用Microsoft Excel 2003對(duì)可溶性糖含量和相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行作圖分析。

表1 所用引物序列Table 1 Primes used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞LbAI的克隆與分析

在NCBI中依據(jù)登錄的茄科植物酸性轉(zhuǎn)化酶基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物F1和R1,克隆出枸杞AI中間片段(圖1),測(cè)序結(jié)果為830 bp。根據(jù)得到的中間保守序列設(shè)計(jì)5′和3′末端的RACE引物,5′端片段測(cè)序結(jié)果為502 bp(圖1),3′端片段測(cè)序結(jié)果1 058 bp(圖1)。將克隆到的3個(gè)部分片段利用ContigExpress軟件進(jìn)行拼接,獲得了枸杞AI基因全長(zhǎng)cDNA序列,全長(zhǎng)2 190 bp,其中ORF為1 920 bp,編碼642個(gè)氨基酸。在編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物F2和R2, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)圖1,測(cè)序結(jié)果為2 252 bp,與拼接結(jié)果的編碼區(qū)大小相符,說(shuō)明拼接結(jié)果正確,該基因命名為L(zhǎng)bAI,GenBank登錄號(hào)為KM191309。

2.2 枸杞LbAI氨基酸序列及進(jìn)化樹(shù)分析

枸杞LbAI的cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸組成如圖2所示,利用DNAStar、ORF Finder和BioXM軟件分析,該序列含有完整的開(kāi)放閱讀框,編碼642個(gè)氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA,編碼產(chǎn)物的分子量為70 600,等電點(diǎn)為5.9;其中酸性氨基酸(Asp+Glu)60個(gè),堿性氨基酸(Arg+Lys)50個(gè)。脂肪系數(shù)為84.19,不穩(wěn)定參數(shù)為40.21,根據(jù)不穩(wěn)定參數(shù)值在40以下為穩(wěn)定蛋白質(zhì),可推斷LbAI所編碼的蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖1 枸杞LbAI的中間片段、5′片段、3′片段和全長(zhǎng)PCR電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product in intermediate,5′RACE,3′RACE and full-length of LbAI gene

經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站和BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)LbAI的核苷酸序列與馬鈴薯(ABF18956.1)、番茄(ADE44160.1)和甜瓜(ABX55832.1)的LbAI核苷酸序列相似性較高,分別為86%、85%和85%;與水稻(AAD10239.1)和苜蓿(AES90955.2)的LbAI核苷酸序列相似性較低,分別為66%和60%。將枸杞與以上5個(gè)物種進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)(圖3),利用Mega6.06軟件將LbAI與NCBI檢索的酸性轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果(圖4)顯示,枸杞與馬鈴薯、番茄等茄科植物親緣關(guān)較近;與梨和苜蓿等關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 枸杞LbAI基因的cDNA序列及其所推導(dǎo)氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of LbAI gene

圖3 枸杞LbAI基因編碼的氨基酸序列與其他物種同源氨基酸序列多重比對(duì)Fig.3 Alignment of the deduced amino acid sequences of wolfberry LbAI and other species

圖4 枸杞LbAI基因編碼的氨基酸序列與其他植物L(fēng)bAI基因編碼的氨基酸序列的發(fā)育樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree of wolfberry and other species based on LbAI amino acid sequence

2.3 枸杞LbAI表達(dá)分析

2.3.1 不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)中LbAI表達(dá)模式

通過(guò)qRT-PCR研究LbAI在不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)中表達(dá)情況(圖5A),并利用氣相色譜法分析不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化(圖5B)。發(fā)現(xiàn)LbAI在開(kāi)花后9～14 d相對(duì)表達(dá)量顯著降低,在開(kāi)花后14～25 d表達(dá)量緩慢降低,在開(kāi)花后25 d達(dá)到最低,之后快速升高,開(kāi)花后34 d(果實(shí)成熟期)的LbAI相對(duì)表達(dá)量升至最高。

糖含量測(cè)定結(jié)果(圖5B)顯示,枸杞果實(shí)中果糖和葡萄糖含量隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育逐漸升高,在開(kāi)花后34 d(果實(shí)成熟期)的升至最高,即為40.7 mg/g和2.49 mg/g;果實(shí)中蔗糖含量隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育逐漸降低,在開(kāi)花后34 d的降至最低,即為0.68 mg/g。比較分析不同發(fā)育階段枸杞果實(shí)中LbAI表達(dá)量與果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)果實(shí)中LbAI表達(dá)量與果糖和葡萄糖含量成線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.627和0.748,而與蔗糖含量成線性負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.519。可見(jiàn),在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,LbAI對(duì)果實(shí)中葡萄糖含量影響較大。

圖5 不同發(fā)育時(shí)期枸杞果實(shí)中LbAI基因表達(dá)量及糖含量Fig.5 Expression level of LbAI and sugar contents in wolfberry fruits at different growth and developmental stages

2.3.2 不同顏色果實(shí)中LbAI表達(dá)模式 通過(guò)對(duì)不同顏色枸杞成熟果實(shí)中LbAI的qRT-PCR分析(圖6A),發(fā)現(xiàn)該基因在黃色果實(shí)中相對(duì)表達(dá)量最高,在黑色果實(shí)中最低,紅色果實(shí)居中,其中,黃色果實(shí)中表達(dá)量是紅色果實(shí)的1.1倍,是黑色果實(shí)的300倍。分析不同顏色枸杞成熟果實(shí)中糖含量變化,結(jié)果(圖6B)顯示,果糖在紅色果實(shí)中最高,為40.7 mg/g;葡萄糖在黃色果實(shí)中最高,為2.8 mg/g;果糖與葡萄糖在黑色果實(shí)中均最低,分別為7.7 mg/g和1.1 mg/g)。蔗糖在黑色果實(shí)中最高,為1.38 mg/g;在紅色果實(shí)中最低,為0.68 mg/g。比較不同顏色枸杞果實(shí)中LbAI表達(dá)量與果實(shí)中果糖、葡萄糖和蔗糖含量變化的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)果實(shí)中LbAI表達(dá)量與果糖、葡萄糖含量成線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.496和0.996,而與蔗糖含量成線性負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.995?？梢?jiàn),LbAI對(duì)不同顏色果實(shí)中葡萄糖和蔗糖含量影響較大。

圖6 不同顏色枸杞果實(shí)中LbAI基因表達(dá)量及糖含量Fig.6 Expression level of LbAI and sugar contents in differently-coloured fruit of wolfberry

3 討論

自從胡蘿卜中分離出第一個(gè)酸性轉(zhuǎn)化酶基因[17]以來(lái),現(xiàn)已從番茄[18]、馬鈴薯[19]、擬南芥[20]、葡萄[21]、甜瓜[12]、甘蔗[22]等多種作物中分離到編碼該酶的全長(zhǎng)或部分核苷酸序列。這些基因分為兩大類:一類是堿性等電點(diǎn)的與細(xì)胞壁緊密相連轉(zhuǎn)化酶,另一類是酸性等電點(diǎn)的液泡酸性轉(zhuǎn)化酶[23]。本研究通過(guò)同源克隆法從寧夏枸杞果實(shí)中成功獲得AI的cDNA序列,并擁有完整的編碼框,根據(jù)AI基因編碼的氨基酸序列分析,枸杞與其他茄科物種具有很高的同源性。利用PSORT在線服務(wù)器進(jìn)行AI基因所編碼蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)可能位于液泡上,可見(jiàn),LbAI屬于液泡酸性轉(zhuǎn)化酶基因。

本研究通過(guò)qRT-PCR技術(shù),分析寧夏枸杞不同發(fā)育階段果實(shí)中LbAI表達(dá)特征,發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育LbAI表達(dá)水平呈現(xiàn)出高-低-高趨勢(shì),其中,成熟果實(shí)中LbAI高度表達(dá),且顯著高于其他發(fā)育階段。這與番茄TIAI在成熟果實(shí)中高度表達(dá)相一致[24],但不同于甜橙AI在果實(shí)成熟過(guò)程中的逐漸減弱表達(dá)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)LbAI表達(dá)高峰在枸杞果實(shí)成熟期。前人對(duì)玉米[26]和木薯[27]的轉(zhuǎn)化酶基因的研究也得出相似的結(jié)論。本研究對(duì)不同顏色成熟枸杞果

實(shí)中LbAI的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)LbAI在3份枸杞材料中都有表達(dá),且在黃色果實(shí)中表達(dá)量最高,在黑色果實(shí)中最低,紅色果實(shí)居中。這些結(jié)果表明LbAI參與不同顏色枸杞果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育,其在黃色果實(shí)中的高表達(dá)有利于促進(jìn)果糖積累,這與AI參與甘蔗和甜橙調(diào)節(jié)果實(shí)中糖分積累[22,28]相一致,但該基因是否與枸杞果實(shí)花色素苷生物合成有關(guān)需要進(jìn)一步研究。本研究測(cè)定了寧夏枸杞不同發(fā)育階段和不同顏色果實(shí)中糖含量,隨著果實(shí)的發(fā)育果糖和葡萄糖含量顯著升高,而蔗糖含量不斷降低,這與其他研究一致[4],且果糖和葡萄糖含量和LbAI表達(dá)量從開(kāi)花后

14 d大體上呈現(xiàn)出相似變化趨勢(shì),在果實(shí)成熟期兩者均達(dá)到最高值;不同顏色果實(shí)中糖含量為紅色果實(shí)果糖含量最高,黃色果實(shí)中葡萄糖含量最高,黑色果實(shí)中兩者含量均最低。枸杞果實(shí)中葡萄糖含量和

LbAI表達(dá)量呈現(xiàn)出較高的一致性(r=0.996**),這說(shuō)明LbAI對(duì)枸杞果實(shí)中糖積累具有主要作用。有關(guān)果實(shí)中LbAI是否還有其他功能還有待于進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯:袁 偉)

Cloning and expression of acid invertase gene(LbAI)in wolfberry(Lycium barbarum L.)

ZHAO Jian-hua1,2, LI Hao-xia3, YIN Yue2, AN Wei2, WANG Hua-fang1, WANG Ya-jun2, SHI Zhi-gang2
(1.College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing100083,China;2.Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences/National Wolfberry Engineering Research Center,Yinchuan 750002,China;3.Desertification Control Research Institute,Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Yinchuan 750002,China)

The acid invertase gene(LbAI)full-length cDNA sequence from the fruits of wolfberry(Lycium barbarum L.)was clone by rapid amplification of cDNA ends(RACE),the features of LbAI-encoded protein were analyzed by bioinformatics software,and the patterns of gene expression and accumulation of soluble sugars at different fruits growth stages and differently-colored fruits of wolfberry were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR)and gas chromatography(GC).The full length of LbAI cDNA sequence was 2 252 bp,containing a 1920 bp open reading frame(ORF)which encoded 642 amino acids with a relative molecular mass of 70 600 and isoelectric point (pI)of 5.9.The phylogenetic tree showed that LbAI had the closest genetic relationship with Solanum tuberosum and S.lycopersicum,with the similarities above 85%.The contents of glucose and fructose increased along with thefruit growth and development,while sucrose content declined.The contents of glucose and fructose in red and yellow fruits were significantly higher than those in black fruit at maturity.The content of sucrose in black fruit was the highest and in red fruit was the lowest.The expression level of LbAI was consistent with the glucose content in fruits.It was suggested that LbAI might play an important role in sugar accumulation of wolfberry fruits.

wolfberry;acid invertase;gene cloning;expression;soluble sugar

S567;Q785

A

1000-4440(2015)05-1140-09

趙建華,李浩霞,尹 躍,等.枸杞酸性轉(zhuǎn)化酶基因的克隆與表達(dá)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(5):1140-1148.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.05.031

2015-03-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360191、31060104);寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ13125);寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)基金項(xiàng)目(NKYJ-14-07)

趙建華(1977-),男,甘肅靖遠(yuǎn)人,博士,副研究員,主要從事枸杞種質(zhì)創(chuàng)新與利用研究。(Tel)0951-6886792; (E-mail)zhaojianhua0943@163.com

王華芳,(E-mail)hfwang@bjfu.edu.cn