齊中強， 杜 艷， 劉永鋒

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇 南京210014)

稻瘟病已經(jīng)成為危害世界糧食安全生產(chǎn)的一種重要病害［1-4］。由于經(jīng)濟重要性和遺傳轉(zhuǎn)化的易操作性以及全序列的公布，稻瘟病菌-植物互作模式已經(jīng)成為研究的熱點課題［5］。稻瘟病菌分生孢子在其侵染水稻的過程中扮演著重要角色［6］。分生孢子首先在其頂端產(chǎn)生粘性物質(zhì)，隨后便萌發(fā)產(chǎn)生芽管，最后分化形成附著胞。附著胞的分化主要受細胞周期和程序性死亡等因素調(diào)控。附著胞內(nèi)部通過甘油的積累可以產(chǎn)生大約8 MPa 的膨壓，從而產(chǎn)生侵入釘，穿破寄主表皮進入細胞內(nèi)。侵入后，侵入釘會分化成侵染菌絲，進而在植物細胞內(nèi)定殖，隨著時間的延長，就會形成可見的典型稻瘟病斑。當外界條件(溫度、濕度)適宜時，病組織上會重新長出孢子梗，進而產(chǎn)生分生孢子，繼續(xù)進行再侵染［7］。Rho 蛋白是Ras 超家族中最早被克隆出來的一類蛋白質(zhì)，它們是一組相對分子質(zhì)量約為2.0×104～2.5×104的三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，具有GTP 酶活性，主要調(diào)控細胞骨架的形成及細胞形態(tài)建成［8］。Rho 蛋白和其他類型的G 蛋白具有相似的功能，作為一種分子開關，具有GTP 結(jié)合的活性狀態(tài)和GDP 結(jié)合的失活狀態(tài)。激活蛋白Bem2主要行使GTPase 激活功能，促使GTP 向GDP 的轉(zhuǎn)換，加速Rho 蛋白的失活。為了明確Rho 蛋白GTPase 激活蛋白在稻瘟病菌中的功能，本研究通過基因敲除的方法，對稻瘟病菌中Rho 型GTPase 激活蛋白MoBem2 功能進行解析。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)Guy11 和水稻品種CO39(感病品種)由南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院真菌與卵菌實驗室提供。完全培養(yǎng)基CM、產(chǎn)孢培養(yǎng)基SDC 的配制方法參照文獻［9］。

1.2 試驗方法

1.2.1 敲除載體構(gòu)建及稻瘟病菌敲除轉(zhuǎn)化 通過稻瘟病菌全基因組序列公布網(wǎng)站，下載預測到的MoBEM2 基因序列。將稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫中MoBEM2 基因上、下游各1 kb 左右的DNA 序列作為同源重組的上、下兩臂，構(gòu)建基因敲除載體。以野生型Guy11 基因組DNA 為模板，分別用引物bem2-p1(F)/bem2-p2(R)和bem2-p3(F)/bem2-p4 (R)擴增上、下臂片段，經(jīng)電泳、切膠回收將PCR 產(chǎn)物純化。再以這兩臂片段為模板，用引物bem2-p1(F)/bem2-p4(R)進行Over-lap PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物切膠回收后連接到pMD19-T simple vector(TaKaRa，Dalian，China)得到質(zhì)粒pMD∶∶BEM2，并送交上海Invitrogen 公司測序，其中引物bem2-p2 和bem2-p3序列中設有EcoRV 酶切位點。以質(zhì)粒pCB1003 為模板，用引物FL1111 (F)/FL1112 (R)高保真PCR擴增抗性篩選基因—潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPH)，所用的高保真酶為Primer STAR(TaKaRa，Dalian，China)，反應程序為:98 ℃10 s，56 ℃15 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)。擴增得到的平末端PCR 產(chǎn)物切膠回收后插入EcoR V 酶切過的質(zhì)粒pMD∶∶BEM2 中，得到敲除載體pMD∶∶BEM2∶∶HPH。以該質(zhì)粒為模板，用引物bem2-p1(F)/bem2-p4(R)擴增得到約3.4 kb 的敲除片段用于稻瘟病菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法參照文獻［10］。

1.2.2 轉(zhuǎn)化子驗證及Southern 雜交 提取轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子基因組DNA(CTAB 法)，用引物bem2-p5(F)/bem2-p6(R)進行驗證，隨后將驗證得到的候選突變體進行Southern 雜交。以稻瘟病菌野生型Guy11 基因組DNA 為模板，用引物bem2-p5(F)/bem2-p6(R)擴增出MoBEM2 基因內(nèi)部889 bp 片段，以此片段作為探針，并用地高辛標記。Guy11 菌絲基因組DNA 經(jīng)EcoR I 酶切于1.0%瓊脂糖凝膠中過夜電泳，充分分離酶解片段，然后轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜(HybondTM-N+，Amersham，Biosciences UK Limited)上，與地高辛標記的探針于58 ℃雜交過夜。Southern 雜交過程參照Digoxigenin high-prime DNA labeling and the detection starter kit 1(Roche，Germany)的操作手冊。以上引物序列見表1。

1.2.3 分生孢子的誘導產(chǎn)生 將野生型Guy11 及敲除突變體接種在SDC 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 左右，待菌絲體長滿平板后，用手術(shù)刀將表面氣生菌絲刮掉，于黑光燈下照射3 d，誘導分生孢子產(chǎn)生。收集孢子時，向培養(yǎng)基內(nèi)加入3 ml 無菌水，輕輕用1.5 ml EP 管底部將表面氣生菌絲和孢子刷下，再經(jīng)過4 層擦鏡紙過濾收集孢子。

1.2.4 附著胞形成的觀測 將蓋玻片(Fisherbrand，12-540-A 18 ×18-2)放置在載玻片上(下面滴加無菌水)，取40 μl 濃度為1 ml 5 ×104個的分生孢子液，滴加于蓋玻片中央，隨后將載玻片放入培養(yǎng)皿中28 ℃黑暗保濕培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、24 h 和48 h后分別制片觀測附著胞形成率。設置3 個重復。

1.2.5 水稻噴霧接種及大麥離體致病性測定 將刷下的分生孢子液濃度調(diào)至1 ml 5 ×104個，加入0.25%明膠，噴霧接種生長14 d 的水稻，28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，隨后16 h 光照，8 h 黑暗，處理期間需要保持高溫高濕狀態(tài)。接種5 ～7 d 后，觀察結(jié)果。大麥離體致病性測定:剪取生長14 d 的大麥葉片鋪于含有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中，將孢子液濃度調(diào)至1 ml 5 ×104個，加入0.25%明膠，每片葉片滴3 滴孢子液，以清水做對照，置于28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，隨后16 h 光照，8 h 黑暗處理。接種5 ～7 d 后，觀察結(jié)果。試驗重復3 次。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 水稻葉鞘侵染 取生長28 d 的水稻植株，剝?nèi)ネ饷嫒~片，留存倒數(shù)第2 片葉鞘和新葉，將新葉慢慢取出，保留葉鞘部分。收集野生型和突變體分生孢子，調(diào)配孢子液濃度為1 ml 1 ×105個，用1 ml注射器將孢子液注入葉鞘內(nèi)，隨后放入保濕培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，水稻根部覆蓋脫脂棉保濕。48 h 后，用手術(shù)刀將葉鞘切斷，選取距根部較近部位用眼科鑷撕取葉鞘內(nèi)表皮，隨后制片觀察并拍照。每個菌株處理10 株水稻葉鞘。

1.2.7 分生孢子熒光增白劑(CFW)染色 將10 mg/ml的CFW 染色液稀釋1 000倍，加入準備好的孢子懸浮液中，避光染色5 min，隨后用無菌水沖洗數(shù)次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病菌MoBEM2 基因敲除突變體的獲得

利用同源重組原理對稻瘟病菌中的MoBEM2基因進行了定向敲除(圖1)，經(jīng)初步驗證獲得#23和#32 2 個轉(zhuǎn)化子。Southern 雜交結(jié)果(圖2)顯示，兩個突變體用基因探針沒有雜交出4.7 Kb 條帶，說明已被成功敲除，進一步用潮霉素探針雜交出了約6.7 Kb 條帶，證明MoBEM2 基因已被潮霉素基因成功替換。

2.2 MoBEM2 基因敲除突變體的孢子形態(tài)

將稻瘟病菌野生型Guy11 和#23 突變體及互補轉(zhuǎn)化子分別接種到SDC 培養(yǎng)基中，隨后誘導產(chǎn)孢。發(fā)現(xiàn)突變體分生孢子產(chǎn)量顯著降低(下降40%左右)(圖3)，孢子形態(tài)發(fā)生改變(圖4)，分生孢子只形成一個隔膜(約占40%左右)，而野生型中超過90%均為正常孢子(圖5)，說明MoBem2 參與了稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成。

圖1 MoBEM2 基因替換策略簡圖Fig.1 Schematic illustration of MoBEM2 targeted gene replacement

圖2 MoBEM2 敲除突變體Southern 雜交驗證Fig.2 Southern blot of MoBEM2 deletion mutant

2.3 MoBEM2 基因敲除突變體附著胞的形成率

稻瘟病菌附著胞的形成對其致病性是必須的［11］，因此檢測了MoBEM2 敲除突變體附著胞形成情況。結(jié)果(圖6)表明，突變體分生孢子在培養(yǎng)8 h時附著胞形成率顯著低于野生型和互補轉(zhuǎn)化子，但隨著時間延長，該缺陷恢復，至24 h，突變體附著胞形成率與野生型沒有差異。說明MoBEM2 基因敲除延緩了稻瘟病菌附著胞的形成。

圖3 MoBEM2 敲除突變體分生孢子產(chǎn)量Fig.3 Conidial production of MoBEM2 deletion mutant

圖4 MoBEM2 敲除突變體分生孢子形態(tài)Fig.4 Conidial morphology of MoBEM2 deletion mutant

圖5 MoBEM2 敲除突變體不同形態(tài)分生孢子百分比Fig.5 Percentage of uniseptate and normal conidial morphology of MoBEM2 deletion mutant

圖6 MoBEM2 突變體附著胞形成率Fig.6 Appressorium formation rate of MoBEM2 deletion mutant

2.4 MoBEM2 基因敲除突變體的致病性

將野生型、敲除突變體和互補轉(zhuǎn)化子的分生孢子配制成濃度為1 ml 5.0 ×104個的孢子懸浮液(含0.25%明膠)，分別采用水稻植株噴霧和大麥離體葉片點滴的方法進行致病性測定。結(jié)果顯示，在兩種接種條件下，敲除突變體發(fā)病情況與野生型、互補轉(zhuǎn)化子均無差異，表明MoBEM2 基因在稻瘟病菌致病過程中不起作用(圖7)。

圖7 MoBEM2 敲除突變體對水稻和大麥的致病性Fig.7 Pathogenicity to rice (A)and barley (B)of MoBEM2 deletion mutant

3 討論

Rho 型蛋白通過與特異性的鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF)結(jié)合而被激活，與GTP 酶激活蛋白(GAPs)結(jié)合而失活［12］。本試驗以稻瘟病菌中一個Rho 型蛋白GTP 酶激活蛋白MoBem2 為研究對象，通過基因敲除，發(fā)現(xiàn)MoBem2 參與稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成，延緩附著胞的形成。

分生孢子在稻瘟病菌的致病過程中具有重要作用［13］。稻瘟病菌中，MoRac1 主要參與稻瘟病菌分生孢子的形成以及形態(tài)建成，并且調(diào)控稻瘟病菌對水稻的致病力［14］。本研究中，敲除Rho 型GTP 酶激活蛋白編碼基因MoBEM2 后，該突變體出現(xiàn)單隔的分生孢子，分生孢子產(chǎn)量也顯著下降，推測該基因參與分生孢子的形成及形態(tài)建成。上述結(jié)果表明Rho 蛋白主要通過其激活和失活調(diào)控稻瘟病菌分生孢子的形態(tài)建成，在這個過程中，GTP 酶的作用尤為明顯。此外，MoHOX2 作為Homeobox 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，敲除后稻瘟病菌喪失產(chǎn)孢能力［15］。2 個SNARE 蛋白MoVam7［16］和MoSec22［17］同樣參與了稻瘟病菌的產(chǎn)孢過程，兩者的敲除突變體均喪失產(chǎn)孢能力。說明了稻瘟病菌分生孢子的調(diào)控涉及多種機制。

附著胞在稻瘟病菌侵染過程中起著至關重要的作用［18］。MoBEM2 敲除突變體分生孢子在誘導界面上能夠形成附著胞，但在附著胞形成早期，突變體附著胞形成率顯著降低，但在后期與野生型沒有差別。說明該基因一定程度上影響稻瘟病菌附著胞早期的形成，但不影響稻瘟病菌的致病性。綜上所述，MoBem2 參與了稻瘟病菌分生孢子的形成及形態(tài)建成過程，這對認識稻瘟病菌致病過程有重要意義。

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