徐重新， 張存政， 何 鑫， 張留娟， 張 霄， 仲建鋒， 劉 媛， 謝雅晶， 劉賢金

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在芽胞形成時產(chǎn)生的Bt毒素對多種昆蟲具殺蟲活性［1-3］。自Bt 被發(fā)現(xiàn)以來就一直作為生物農(nóng)藥用于各類害蟲的防治，目前占據(jù)了微生物農(nóng)藥95 % 以上的市場［4］。Cry1F 毒素是Bt 毒素的一種，主要用于防治地上鱗翅目害蟲［5］?，F(xiàn)有轉(zhuǎn)Cry1F 毒素的轉(zhuǎn)基因作物主要為玉米和棉花，如抗蟲玉米TC1507、抗蟲棉花281-24-236 等，均已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)和推廣。目前Cry1F 毒素的檢測方法主要是基于單克隆抗體、多克隆抗體的免疫學(xué)檢測方法，包括ELISA 法［6-7］和商業(yè)化的免疫金標(biāo)試紙條法等，另外還有采用表面等離子共振技術(shù)檢測的報道［8］。

噬菌體抗體庫技術(shù)是基于基因工程抗體改造技術(shù)發(fā)展而來的噬菌體表面展示技術(shù)。該技術(shù)的原理是將改造后的抗體基因克隆到絲狀噬菌體噬菌粒載體上，隨著噬菌粒串聯(lián)共表達(dá)，使其展示在噬菌體衣殼蛋白質(zhì)表面形成融合形式蛋白質(zhì)抗體，從而將抗體的表型和基因型聯(lián)系為一體，再通過與固相化抗原結(jié)合的特性進(jìn)行篩選，獲得抗原特異性的單鏈抗體(scFv)［9］。噬菌體抗體庫技術(shù)，避免了傳統(tǒng)方法獲取單克隆抗體、多克隆抗體所要經(jīng)歷的抗原乳化、動物免疫及采血等繁瑣過程，通過抗體庫富集篩選直接獲得具有抗原結(jié)合活性的抗體，并可以進(jìn)一步在基因水平上改造抗體的結(jié)構(gòu)和功能，同時也能在原核、真核以及重組病毒中進(jìn)行快速、大量的表達(dá)。Garet 等［10］利用噬菌體抗體庫技術(shù)成功篩選到了具有抗?？舅鼗钚缘膕cFv，并建立了免疫學(xué)檢測方法。Zhang 等［11］也從噬菌體抗體庫中篩選到了抗Cry1B 毒素的scFv，并建立了針對Cry1B 毒素的間接競爭ELISA 檢測方法，均取得了良好效果。本研究旨在利用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選具有Cry1F 毒素結(jié)合活性的scFv，并建立有別于單克隆抗體、多克隆抗體的新型基因工程改造抗體檢測Cry1F 毒素的免疫學(xué)檢測方法，為轉(zhuǎn)Cry1F 毒素基因作物及其產(chǎn)品的檢測探索新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Cry1F、Cry1C、Cry1B、Cry1Ab、Cry1Ac 毒 素標(biāo)樣購自上海佑隆生物科技有限公司;Tomlinson I 噬菌體抗體庫、輔助噬菌體KM13、Escherichia coli TG1、E. coli HB2151 購自英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和蛋白質(zhì)基因工程中心;酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司;酶標(biāo)板購自美國Corning 公司;anti-M13［HRP］antibody、anti-His［HRP］antibody、His-Trap HP、超微量分光光度計Nano Vue Plus spectrophotometer 購自美國GE 公司;卡那霉素、氨芐青霉素購自美國Sigma 公司;DNA marker、protein marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗Cry1F 毒素scFv 的富集 將500 μl Tomlinson I 噬菌體抗體庫菌液加入2 × TY-AG 培養(yǎng)基(含終濃度100 μg/ml的Amp、1%的葡萄糖)中，37℃培養(yǎng)到OD600為0.4。取50 ml 菌液，加入1 ×1012PFU 輔助噬菌體KM13 進(jìn)行侵染，37 ℃孵育30 min，3 300 g 離心10 min，棄上清液，沉淀用100 ml 2 ×TY-AKG 培養(yǎng)基(含終濃度100 μg/ml的Amp、50 μg/ml的Kana、1 %的葡萄糖)重懸，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日3 300 g 離心30 min，取上清液并加入20 ml PEG/NaCl 溶液，冰浴1 h ，3 300 g 離心30 min，棄上清液，用4 ml PBS 重懸沉淀，再以11 600 g 離心10 min，收集上清液，即為擴(kuò)增的噬菌體抗體庫，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。取擴(kuò)增的Tomlinson I 庫與固相化包被的Cry1F 毒素共同孵育:第1 輪將4 ml 75 μg/ml (其后2 輪依次為50 μg/ml、10 μg/ml)Cry1F 毒素包被于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，4 ℃過夜，次日用1 ml PBS 清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶3 次。取擴(kuò)增的抗體庫與4 ml 3 %的MPBS(PBS 溶液中含有3 %的脫脂奶粉)溶液充分混勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，室溫下緩慢搖動1 h，再靜置1 h ，傾去瓶中液體。以PBST(PBS 溶液中含有0.05%的吐溫-20)洗瓶數(shù)次，然后加入1 ml 胰蛋白酶(Trypsin)溶液洗脫特異性結(jié)合的噬菌體scFv，收集后侵染E. coli TG1 擴(kuò)增進(jìn)行下一輪篩選。如此3 輪篩選即可富集與Cry1F 毒素特異性結(jié)合的噬菌體scFv。

1.2.2 抗Cry1F 毒素scFv 的篩選及鑒定 取第3輪富集的噬菌體scFv 侵染E.coli TG1，37 ℃孵育1 h 后，涂布于TYE-AG(含終濃度100 μg/ml的Amp、1.0%的葡萄糖、1.5%的瓊脂)上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取長出的單菌落，接種到加有2 ×TY-AG 培養(yǎng)基的96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。從板孔中吸出2 μl 轉(zhuǎn)接到新的96 孔板中，37 ℃孵育2 h，每孔加入25 μl 輔助噬菌體，30 ℃孵育2 h，1 800 g 離心10 min，用150 μl 2 ×TY-AK 重懸沉淀后30 ℃培養(yǎng)過夜。次日1 800 g 離心30 min，取上清液加入到包被有Cry1F 毒素(濃度為4 μg/ml)的96 孔板中，陰性對照為等量的2 × TY 培養(yǎng)基。37 ℃水浴2 h，以PBS 洗板3 次，加入100 μl anti-M13［HRP］(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，再次洗板，然后加入100 μl四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，室溫反應(yīng)15 min，以50 μl 濃度為1.96 g/ml 的H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測OD450值，陽性/陰性大于2.1，即判斷為陽性。

1.2.3 抗Cry1F 毒素scFv 的可溶性表達(dá) scFv的可溶性表達(dá)及純化方法參考文獻(xiàn)［11］步驟進(jìn)行。

1.2.4 IC-ELISA 檢測方法的建立及特異性分析取酶標(biāo)板，板孔加入100 μl 以CBS 稀釋的Cry1F 毒素(2.5 μg/ml)，室溫包被過夜。洗板3 次后，加入200 μl 3%的MPBS 溶液，37 ℃水浴封閉2 h，再次洗板，每孔分別加入50 μl 濃度為2.0 μg/ml的可溶性scFv 和50 μl 濃度為10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、600 ng/ml、800 ng/ml的Cry1F 毒素標(biāo)樣混合液，37 ℃水浴2 h，洗板加入100 μl anti-His［HRP］(1∶ 1 000)，37 ℃水浴2 h。洗板加入四甲基聯(lián)苯胺顯色液，室溫反應(yīng)15 min，終止反應(yīng)。測OD450，以Cry1F 毒素濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，建立Cry1F 毒素的IC-ELISA 檢測方法。分別以Cry1F 毒素的類似物:Cry1C、Cry1B、Cry1Ab、Cry1Ac 作為競爭抑制物，測定交叉反應(yīng)率(CR)［12］，評價該方法的抗原特異性。

1.2.5 添加回收試驗(yàn) 取玉米烘干磨成粉，過100目篩，稱取1 g 加入到4 ml 試管中，共3 管。隨后加入Cry1F 毒素，充分混勻，使其終濃度分別為10 ng/g、100 ng/g、500 ng/g。每管加入1 ml 樣品提取液(0.10 mol/L 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6，0.05%Tween-20)，室溫振蕩4 h ，然后5 000 r/min 離心5 min ，取上清液保存待用。分別取上述3 個濃度的提取物溶液，同1 d 每個樣品測3 次，連續(xù)測3 d，計算添加回收試驗(yàn)中Cry1F 毒素的回收率(回收率=檢測值/理論值×100 %)及變異系數(shù)(CV =相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/回收率)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性多克隆噬菌體scFv 的免疫分析

特異性多克隆噬菌體免疫分析，是采用非競爭ELISA 法對原始抗體庫和3 輪富集篩選的次級庫對抗原的整體親和力進(jìn)行鑒定。如圖1 所示，原始抗體庫噬菌體的ELISA 值(OD450)為0.21，第1 輪富集篩選后的次級庫OD450為0.34，第2 輪富集篩選后的次級庫OD450為0.82，第3 輪富集篩選后的次級庫OD450為1.50。結(jié)果表明，經(jīng)過3 輪富集篩選后，抗原特異性噬菌體得到有效富集，可用于抗Cry1F 毒素scFv 的篩選。

2.2 陽性單克隆的ELISA、PCR 及測序鑒定

經(jīng)第3 輪篩選后，隨機(jī)挑取噬菌體單克隆進(jìn)行單克隆噬菌體ELISA 鑒定，以陽性值/陰性值(P/N)大于2.1 為陽性標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果篩選出11 個陽性單克隆(圖2)。經(jīng)通用引物(LMB3:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3';pHEN:5'-CTATGCGGCCCCATTCA-3')進(jìn)行PCR 鑒定(圖3)，11 個陽性單克隆均含有935 bp 大小的目的基因條帶。選取H1 和G9陽性單克隆菌種進(jìn)行DNA 測序(圖4)，經(jīng)NCBI 比對分析，均具有3 個完整的重鏈可變區(qū)(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)、輕鏈可變區(qū)(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)，及1 條重、輕鏈之間的Link 序列，由此確認(rèn)為人源化的scFv 基因。H1 和G9 的scFv 蛋白氨基酸序列僅在L-CDR1 區(qū)存在2 個氨基酸的差異，我們初步推斷L-CDR1 區(qū)可能是影響scFv 抗原結(jié)合活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖1 3 輪篩選的多克隆噬菌體免疫分析結(jié)果Fig.1 Immunoassay of polyclonal phage after three rounds of binding

圖2 ELISA 篩選陽性單克隆Fig.2 ELISA for screening positive monoclones

圖3 11 株陽性克隆的PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of 11 positive clones

圖4 H1、G9 陽性重組噬菌體scFv 的氨基酸序列Fig.4 The amino acid sequences of positive recombinant phage scFv of H1 and G9

2.3 scFv 的可溶性表達(dá)

將G9 陽性噬菌體scFv 通過宿主替換的方式導(dǎo)入到E. coli HB2151 中進(jìn)行可溶性表達(dá)，收集培養(yǎng)上清液過anti-His-Tag 親和層析柱純化，采用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白質(zhì)。如圖5 所示，通過不同濃度(50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L)的咪唑洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，上清液中雜蛋白質(zhì)被逐級洗脫下來，目的蛋白質(zhì)獲得純化，最后在400 mmol/L 咪唑洗脫緩沖液(泳道4)中收集到了大量純化的scFv 蛋白質(zhì)，定容至1 ml，經(jīng)微量分光光度計測得目的蛋白質(zhì)濃度為256 μg/ml。由此說明抗Cry1F 毒素的scFv(G9)在E. coli HB2151中的可溶性表達(dá)獲得成功，可進(jìn)行下一步活性測定及抗原特異性分析。

圖5 scFv 經(jīng)不同濃度洗脫液洗脫純化后的SDS-PAGE 電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of scFv after elution and purification

2.4 IC-ELISA 檢測法的建立及特異性分析

如圖6 所示，以可溶性表達(dá)的scFv(G9)為檢測抗體，采用IC-ELISA 法，建立針對Cry1F 毒素的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。其線性回歸方程為Y =0.099 0x +9. 407 0(R2= 0.989 2)，其中，Y 為抑制率(%)，x 為Cry1F 毒素濃度(ng/ml)。計算得到該檢測方法的檢測靈敏度(IC10)為5. 99 ng/ml，抑制中濃度(IC50)為0. 410 μg/ml，線性檢測范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0. 107 ～0. 713 μg/ml。Cry1B、Cry1C、Cry1Ab 和Cry1Ac 作為Cry1F 毒素的類似物，在建立的IC-ELISA 法中測得交叉抑制試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，scFv(G9)對Cry1C、Cry1B 均具有一定的識別能力，交叉反應(yīng)率分別達(dá)到了20. 92 % 和15. 59 %，而對Cry1Ab、Cry1Ac 交叉反應(yīng)率均低于0. 1%，識別能力幾乎可以忽略。

圖6 IC-ELISA 法檢測Cry1F 毒素的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.6 Standard inhibition curve for Cry1F toxin by IC-ELISA

表1 Cry1F 毒素類似物的交叉反應(yīng)Table 1 Cross reactivity between scFv and Cry1F toxin analogous

2.5 Cry1F 毒素在玉米中的添加回收

為測試基于scFv(G9)的IC-ELISA 檢測法的實(shí)用性，我們在該方法線性檢測范圍(IC20～I(xiàn)C80)內(nèi)，分別做了500 ng/g、100 ng/g、10 ng/g 3 個Cry1F 毒素濃度水平在玉米中的添加回收試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，3 個樣品濃度的批內(nèi)回收率為85.43% ～94.71%，變異系數(shù)為6.43% ～9.13%;批間回收率為 82.26% ～91.61%，變 異 系 數(shù) 為 7.99% ～9.00%。批內(nèi)、批間試驗(yàn)均滿足儀器檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。

3 討論

Tomlinson I 噬菌體抗體庫表達(dá)載體pIT2 是由絲狀噬菌體改造而來的一種噬菌粒，在多克隆位點(diǎn)與gⅢ蛋白質(zhì)編碼區(qū)之間有1 個His-tag 序列和琥珀終止密碼子(UAG)。當(dāng)攜帶scFv 基因的噬菌粒在琥珀突變抑制基因的宿主(E. coli TG1)中表達(dá)時，UAG 被譯讀為谷氨酸，scFv 與gⅢ蛋白質(zhì)融合，在輔助噬菌體的營救下，組裝成展示在噬菌體衣殼蛋白質(zhì)表面的融合形式的scFv;當(dāng)攜帶scFv 基因的噬菌粒在非琥珀突變抑制的宿主(E.coli HB2151)中時，UAG 則被譯讀為終止密碼子，scFv 終止于His-tag，形成可溶性的scFv-Histag 蛋白質(zhì)，并被分泌到胞外［13］。本研究正是利用Tomlinson I 噬菌體抗體庫的這個特點(diǎn)，先從庫中篩選具有Cry1F 毒素結(jié)合活性的展示型噬菌體scFv，然后通過宿主替換的方式(由E. coli TG1替換為E. coli HB2151)，直接將展示型的噬菌體scFv 轉(zhuǎn)為能可溶性表達(dá)的scFv-His-tag 蛋白質(zhì)，并通過His 標(biāo)簽進(jìn)行純化收集和間接活性測定。該方法跳過了外源基因在表達(dá)時需要“構(gòu)建重組載體→化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞”的繁瑣過程，大大提高了獲取scFv 蛋白質(zhì)的效率。以可溶性scFv(G9)為檢測抗體建立的IC-ELISA 法檢測靈敏度(IC10)為5. 99 ng/ml，比商業(yè)化的轉(zhuǎn)Bt 基因毒素ELISA 檢測試劑盒(IC10為0. 5 ng/ml)［14］的靈敏度約低10 倍。由此說明，初篩的scFv 抗原結(jié)合活性與單克隆抗體、多克隆抗體還存在一定差距，不過，在后期研究中可以考慮采用不同的表達(dá)系統(tǒng)(昆蟲細(xì)胞表達(dá)［15］)和抗體親和力成熟改造技術(shù)(易錯PCR［16］、定點(diǎn)突變［17］、鏈置換［18］等)，進(jìn)一步提高scFv 的親和活性，以達(dá)到檢測所需靈敏度的要求。從抗原特異性來看，因?yàn)檫x取的對象(Cry1B、Cry1C、Cry1Ab、Cry1Ac)少，并不能有效說明scFv(G9)是否具有廣譜識別能力，后期可以擴(kuò)大抗原類似物種類(如:Cry1Aa、Cry1D、Cry1E、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3A、Cry34/Cry35 等)進(jìn)行交叉抑制試驗(yàn)，并從中摸索規(guī)律，為scFv 的廣譜識別檢測改造提供指導(dǎo)。

表2 玉米中Cry1F 毒素的IC-ELISA 檢測法批內(nèi)、批間的添加回收率和變異系數(shù)Table 2 Recoveries and coefficients of variation of intra-and inter-assays for detection of Cry1F toxin by IC-ELISA in corn

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