雷明明, 吳思謙, 李孝偉, 施振旦

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014;2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,廣東廣州 510642)

雞瘦素受體胞外域成熟肽重組蛋白質(zhì)的表達以及多克隆抗體的制備

雷明明1, 吳思謙2, 李孝偉2, 施振旦1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所動物品種改良和繁育重點實驗室,江蘇南京 210014;2.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,廣東廣州 510642)

根據(jù)雞瘦素受體基因(LEPR)編碼區(qū)序列(GenBank:NM_AB033383)設計并合成2對引物,以雞肝臟cDNA為模板擴增雞LEPR胞外域2段cDNA序列。然后將這2段序列克隆到表達載體pRSET-A的BamH I和Hind III酶切位點之間,構建重組表達載體(pR-LEPR1和pR-LEPR2)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化菌在IPTG誘導后分別表達了分子量為2.62×104的LEPR1和分子量為2.86×104的LEPR2重組蛋白質(zhì)。經(jīng)凝膠Ni-NTA純化后的重組蛋白質(zhì)與礦物油佐劑混合免疫生長雞,經(jīng)過3次免疫之后,獲得高效價的抗LEPR1和抗LEPR2抗血清。

瘦素受體;成熟肽序列;克隆和表達;多克隆抗體

瘦素(Leptin)是由白色脂肪細胞分泌的一種多肽,在調(diào)節(jié)攝食、代謝和能量平衡方面有重要作用[1-2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),瘦素可以抑制下丘腦神經(jīng)肽Y和促進肥胖素(Orexin)的表達來抑制攝食[3]。在外周能量代謝調(diào)控中,瘦素可以通過降低血糖濃度和提高AMP激活蛋白激酶(AMPK)的活性來促進代謝[4],刺激脂肪氧化代謝和降低胰島素樣生長因子-I (IGF-I)的分泌來降低甘油三酯的濃度[5-6]。1998年Taouis等首次報道了雞瘦素基因[7],隨后Friedman-Einat等報道無法檢測雞等鳥類血清中的瘦素[8],Hen等利用瘦素信號傳導細胞模型也幾乎檢測不到雞血液瘦素信號[9],Pitel等報道雞基因組缺失哺乳動物瘦素基因座位區(qū)域[10]。最近一些研究者相繼報道發(fā)現(xiàn)了草雀、鴿子、鴨子等瘦素基因片段和基因[11-12]。2014年,日本學者Ohkubo等也報道雞血清中可能存在瘦素[13]。盡管對雞是否存在瘦素仍有爭議,但雞瘦素受體(Leptin receptor,LEPR)是真實存在的,并且在雞的許多組織中表達[14-15]。

LEPR有a、b、c、d、e、f 6種不同的亞型[16],其中a、c、d、e、f這5種是短型受體,b是長型受體。這些亞型中只有長型受體LEPR-b包含了激活JAK-STAT信號傳導途徑所必需的一段胞質(zhì)區(qū)和疏水氨基酸殘基,是瘦素的重要功能性受體。雞LEPR-b有1 148個氨基酸,在胞質(zhì)區(qū)有3個保守的酪氨酸殘基,分別是Tyr985、Tyr1077和Tyrl138,這3個氨基酸在LEPR激活的過程中起重要作用。2014年Lei等研究發(fā)現(xiàn)對生長雞免疫LEPR胞外域后產(chǎn)生的抗LEPR抗體可以顯著加強LEPR的信號轉(zhuǎn)導,促進脂肪代謝相關基因的表達和降低脂肪合成基因的表達,導致脂肪沉積減少[17]。但是,對雞免疫LEPR胞外域后產(chǎn)生的抗LEPR抗體加強LEPR信號轉(zhuǎn)導的作用機理尚不清楚,需要進一步深入研究。因此,本研究旨在通過構建雞受體胞外域蛋白融合表達載體,獲得雞瘦素受體胞外域不同區(qū)域融合蛋白,并且利用融合蛋白制備受體特異性的多克隆抗體,為研究雞瘦素和雞瘦素受體的生物功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pMD18-T載體購自TaKaRa公司,E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)和pRSET-A由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所動物品種改良與繁育重點實驗室保存。限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III、Ex TaqDNA聚合酶、DL2000分子量標準、T4連接酶及膠回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。用于純化的帶His-tag的50%Ni-NTA凝膠(Qiagen)購自基因公司。辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 雞LEPR成熟肽基因序列的克隆、重組蛋白質(zhì)表達和純化

根據(jù)雞LEPR基因編碼區(qū)的核苷酸序列(Gen-Bank:NM_204323.1)設計2對引物并由上海英駿公司合成。第1對引物在N-末端,成熟肽包含第101～300位的共200個氨基酸殘基,上游引物序列為下游引物序列為第2對引物在胞外域的近膜段,成熟肽包含第582～796位上的共215個氨基酸殘基,上游引物序列為下游引物序列為引物中包含有Hind III酶切位點和BamH I酶切位點。將雞的肝臟組織cDNA作為模板,用這2對引物進行PCR擴增,分別得到1條600 bp和1條645 bp的2段LEPR,然后分別將這2段LEPR克隆插入pMD18-T載體構建重組質(zhì)粒pLEPR1和pLEPR2,并將其轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α細胞株增殖復制。

抽提pLEPR1和pLEPR2質(zhì)粒并用BamH I和Hind III雙酶切,經(jīng)凝膠電泳分離回收LEPR1和LEPR2 cDNA片段,并克隆插入表達載體pRSET-A的BamH I和Hind III兩位點之間,構建pR-LEPR1和pR-LEPR2重組載體。將這2個載體轉(zhuǎn)化到E. coliBL21(DE3),用IPTG誘導表達pR-LEPR1和pR-LEPR2重組蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE驗證蛋白的表達和分子大小之后,用50%Ni-NTA凝膠在變性條件下進行純化。

1.3 LEPR1和LEPR2特異性多抗的制備和純化

將純化并透析復性后的LEPR1和LEPR2重組蛋白質(zhì)與白油混合制成含重組蛋白質(zhì)1 mg/ml的油乳劑,并對生長雞進行肌肉注射,每只注射油乳劑1 ml。間隔14 d免疫1次,共免疫3次。每次免疫前翅下靜脈采血,第3次免疫后第5 d翅下靜脈采血。用33%飽和硫酸氨純化多克隆抗體,純化得到的抗體保存于-20℃。

1.4 ELISA檢測抗血清效價

將LEPR1和LEPR2抗原稀釋至濃度為10 μg/ml包被96微孔酶標板,每孔加入100 μl,4℃包被過夜,次日倒掉包被液,用洗滌液(0.05%Tween+ PBS)洗3次,加5%的BSA-PBS于37℃封閉1 h,洗滌3次后依次加免疫血清、HRP羊抗雞IgG(1∶4 000稀釋),最后加底物TMB,37℃顯色25 min,加2 mol/L硫酸終止反應,測定450 nm光吸收值作為抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞LEPR1和LEPR2基因cDNA克隆

從雞肝臟組織中提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增后,獲得2條特異條帶,長度與預期的相符。經(jīng)測序證明獲得的序列為雞LEPR基因cDNA序列,與GenBank中所提交的序列完全一致,包含所引入的2個酶切位點。通過雙酶切和連接將雞LEPR基因2個cDNA片段插入原核表達載體pRSET-A,獲得重組的表達載體pR-LEPR1和pR-LEPR2。經(jīng)過Hind III和BamH I雙酶切鑒定,分別獲得長度長為600 bp和645 bp的片段(圖1)。

圖1 雞LEPR1和LEPR2基因的RT-PCR克隆Fig.1 The amplification of chicken LEPR1 and LEPR2 genes by RT-PCR

2.2 在E.coli BL21(DE3)中表達的雞LEPR1和LEPR2成熟肽及其純化

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pR-LEPR1和pR-LEPR2的E. coliBL21(DE3)株在LB(AMP+)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并經(jīng)IPTG誘導后,表達出分子量約為2.62×104的LEPR1和分子量約為2.86×104的LEPR2重組蛋白質(zhì)(圖2)。對2個重組蛋白質(zhì)進行Western blot分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒有免疫條帶出現(xiàn)(圖2),說明pR-LEPR1和pR-LEPR2正確表達出含有雞LEPR的2段融合蛋白質(zhì)。

圖2 原核表達的雞LEPR1和LEPR2重組蛋白質(zhì)的表達以及純化蛋白質(zhì)的電泳圖譜和Western blot檢測圖Fig.2 The expression of recombinant chicken LEPR1 and LEPR2 proteins,SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein,and Western blot analysis of the recombinant protein

2.3 ELISA檢測血清抗體效價

從圖3可以看出,在免疫LPER1和LEPR2重組蛋白質(zhì)之后雞血清中多克隆抗體LPER1抗體和LEPR2抗體的抗體效價(由ELISA分析的OD值代表)逐漸升高。免疫前血清中抗體效價較低,免疫2次后效價有所上升,免疫3次后效價進一步升高。

圖3 免疫LEPR1、LEPR2和BSA后雞血清中多克隆LEPR1抗體和LEPR2抗體的抗體效價Fig.3 Anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibody titers in chicken antiserum after immunization

2.4 抗LEPR1和LEPR2多克隆抗體的純化

反復用33%飽和硫酸氨提純雞血清,收集蛋白質(zhì)并進行SDS-PAGE電泳。電泳圖譜出現(xiàn)較純的輕鏈(分子量2.5×104)和重鏈(5.5×104)條帶(圖4),抗體純度達到96%以上。用ELISA測定純化后抗體的效價,純化后1.2 mg/ml多克隆抗體按倍比稀釋,隨著抗體濃度越來越低,顯色越來越淺,稀釋至1∶6 400時P/N值仍大于2。

圖4 純化后多克隆抗體的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE profile of purified polyclonal antibody

3 討論

本研究克隆了雞LEPR基因胞外域2段cDNA序列,將雞LEPR基因胞外域2段cDNA序列插入表達質(zhì)粒pRSET-A的BamH I和Hind III兩酶切位點之間,表達出2個融合蛋白質(zhì)。一個融合蛋白質(zhì)由236個氨基酸殘基組成,其N端36個殘基(包括6×His的組氨酸標簽)源自pRSET-A的序列,C端的200個氨基酸殘基源自雞LEPR;另一個融合蛋白質(zhì)有251個氨基酸殘基,同樣N端36個氨基酸殘基(包括6×His的組氨酸標簽)源自pRSET-A的序列, C端的215個氨基酸殘基源自雞LEPR。經(jīng)過多重PCR擴增、酶切和連接等,獲得閱讀框架正確的表達載體pR-LEPR1和pR-LEPR2。所表達的重組蛋白質(zhì)可與Ni-NTA凝膠結(jié)合并被純化,說明蛋白分子中具有來源于表達載體pRSET-A的6個連續(xù)組氨酸標簽序列(His-Tag)。說明分子克隆操作和所表達的重組蛋白質(zhì)分子表達的正確性,為動物免疫實驗等研究工作奠定了基礎。

本研究獲得的多克隆抗體來自于經(jīng)LEPR抗原免疫的雞血清,這種蛋白質(zhì)抗原有多個不同的抗原決定簇,為了獲得特異性高的多克隆抗體需要純度較高的抗原?？筁EPR1和抗LEPR2兩種多克隆抗體的效價測定結(jié)果顯示,隨著免疫次數(shù)的增加,多克隆抗體效價不斷升高?？贵w是一種特殊分子,它不僅可以和受體結(jié)合,而且可以觸發(fā)受體的信號轉(zhuǎn)導,最典型的例子就是Graves病癥,病人自身產(chǎn)生抗TSHR抗體導致甲狀腺功能亢進[18-19]。以受體的胞外區(qū)蛋白質(zhì)作為抗原,通過主動免疫可以不斷提高抗體效價,刺激或拮抗受體信號[20]。對產(chǎn)蛋雞免疫重組蛋白質(zhì)LEPR1后發(fā)現(xiàn)抗LEPR1抗體可以顯著加強LEPR的信號轉(zhuǎn)導,抑制卵泡發(fā)育和降低產(chǎn)蛋率[21];同樣對生長雞免疫融合蛋白質(zhì)LPER2后發(fā)現(xiàn)抗LEPR2抗體也可以顯著加強LEPR的信號轉(zhuǎn)導,促進脂肪代謝和抑制脂肪沉積[17]。這些研究結(jié)果表明對雞免疫LPER蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗LPER抗體加強了Leptin樣物質(zhì)的生物活性。抗體與受體如何作用加強LEPR信號轉(zhuǎn)導的機理并不清楚,需要進一步研究。而本研究所制備的高純度抗LEPR1和抗LEPR2兩種多克隆抗體,則可以應用于研究抗體與受體間的動力學和調(diào)控脂肪代謝和繁殖性狀的研究工作。

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(責任編輯:張震林)

Expression of recombinant protein of chicken leptin receptor extracellular domain mature peptide and the preparation of its polyclonal antibody

LEI Ming-ming1, WU Si-qian2, LI Xiao-wei2, SHI Zhen-dan1
(1.Laboratory of Animal Breed Improvement and Reproduction,Institute of Animal Science,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014, China;2.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Two pairs of primers designed based on the chicken leptin receptor gene(LEPR)mature peptide sequence(GenBank:NM_AB033383)were used to amplify two cDNA sequence fragments of chicken LEPR extracellular domains(ECD)mature peptides with chicken liver cDNA as the template.The two cDNA sequence fragments were cloned into the BamH I and Hind III sites of the plasmid pRSET-A to generate the expression vector pR-LEPR1 and pR-LEPR2,which were further transformed into bacterium Escherichia coli BL21(DE3).The transformed bacteria were induced to produce recombinant proteins LEPR1 and LEPR2 with the expected molecular mass of 2.62×104and 2.86×104by IPTG.The recombinant LEPR1 and LEPR2werepurifiedandmixedintomineraloil adjuvant to immunize growing chickens to produce anti-LEPR1 and anti-LEPR2 antibodies.Antisera with high anti-LEPR1 and anti-LEPR2 titers were obtained after three immunizations.

leptin receptor;mature peptide;cloning and expression;polyclonal antibody

S831.2

A

1000-4440(2015)05-1105-05

雷明明,吳思謙,李孝偉,等.雞瘦素受體胞外域成熟肽重組蛋白質(zhì)的表達以及多克隆抗體的制備[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2015,31 (5):1105-1109.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.05.025

2015-03-05

國家自然科學基金項目(31501946);江蘇省自然科學基金項目(BK20150544)

雷明明(1977-),女,湖北赤壁人,博士,研究方向為動物遺傳與繁殖內(nèi)分泌。(Tel)025-84390772;(E-mail) mm0529@163.com

施振旦(1964-),(Tel)025-84390956;(E-mail)zdshi@ mail.jaas.ac.cn