武彩霞，王 靜 綜述，劉開揚 審校

(河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究進展

武彩霞，王 靜 綜述，劉開揚 審校

(河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000)

隨著基因工程和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，在轉(zhuǎn)基因微生物領(lǐng)域里，枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)已經(jīng)成為一種繼大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)之后的新型表達系統(tǒng)，為外源基因提供了良好的宿主環(huán)境，使外源基因可以進行表達，目前已經(jīng)取得了較顯著的成績。該文闡述了枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究中質(zhì)粒載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化方法、菌株全基因序列及外源基因在枯草芽孢桿菌中的表達等方面的進展。

枯草芽孢桿菌；質(zhì)粒載體；外源基因；表達

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是基因工程的一種技術(shù)手段，以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以微生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法為手段，按照人類的意愿將外源基因通過構(gòu)建表達載體并轉(zhuǎn)入表達宿主菌等，產(chǎn)生人類所需要的目標產(chǎn)物，因此而獲得新的菌株(修飾后的轉(zhuǎn)基因菌株)、新的產(chǎn)品制備法(之前產(chǎn)品制備量少，現(xiàn)在可大規(guī)模生產(chǎn))和新的品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基因結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了強有力的手段，利用轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)醫(yī)藥、工業(yè)、食品及環(huán)境用外源蛋白是微生物技術(shù)研究和開發(fā)的重點之一。目前已經(jīng)能夠利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)許多外源蛋白，如具有活性的LTB抗原蛋白[1]、堿性蛋白酶[2]、乙醇脫氫酶[3]、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[4]等。隨著對枯草芽孢桿菌表達宿主的深入研究，枯草芽孢桿菌將會成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究中重要的宿主菌，具有很重要的理論研究和應(yīng)用價值。

1 枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，簡稱B.subtilis)屬于芽孢桿菌屬，是一類嗜溫、好氧、內(nèi)生抗逆性孢子的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于土壤及腐敗的有機物中。作為革蘭氏陽性細菌的典型代表，對其生理生化，遺傳及分子生物學(xué)的研究已有50多年的歷史[5]。枯草芽孢桿菌是轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用宿主菌之一，其它常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌和農(nóng)桿菌等。

枯草芽孢桿菌也是一種益生菌，作為益生菌被應(yīng)用在多個領(lǐng)域。在食品行業(yè)方面，枯草芽孢桿菌因在生長過程中能產(chǎn)生具有一定抗菌效果的抗菌素，并且研究證明枯草芽孢桿菌不產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)，所以可以作為食品產(chǎn)品的發(fā)酵菌種[6]；在農(nóng)業(yè)上，枯草芽孢桿菌作為一種有效的生防菌已經(jīng)被廣泛使用，不僅可抑制病原菌的生長，還可以促進農(nóng)作物增產(chǎn)[7]；枯草芽孢桿菌目前還可被應(yīng)用在飼料、醫(yī)藥(新型的藥物或抗原投遞系統(tǒng)等)、養(yǎng)殖業(yè)、洗滌和紡織皮革等行業(yè)；枯草芽孢桿菌也可以作為一種微生態(tài)制劑應(yīng)用在多種領(lǐng)域中[8]。

2 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)是緩慢發(fā)展起來的一種表達系統(tǒng)，之前因為芽孢桿菌自身質(zhì)粒沒有標記基因，不利于篩選，所以一直不能被用作表達系統(tǒng)，但自從發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌表達系統(tǒng)可以允許來源于其它菌的載體的復(fù)制和表達，尤其是研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的載體能運用于芽孢桿菌之后，芽孢桿菌表達系統(tǒng)(轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌的載體)被大量應(yīng)用。芽孢桿菌中大多數(shù)可以作為表達宿主，主要包括枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，其中枯草芽孢桿菌是目前使用最多的表達宿主菌。芽孢桿菌屬中其它可以用于外源基因克隆表達的宿主菌有：嗜堿芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、耐熱的芽孢桿菌和病原菌炭疽芽孢桿菌等[9]。

1958年Spizizen首次發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌168菌株能攝取外源基因，后來隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)明，又因為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)帶抗性標志的質(zhì)粒可作為枯草芽孢桿菌載體的發(fā)現(xiàn)(克服了枯草桿菌只有隱秘性質(zhì)粒的困難)及枯草芽孢桿菌全基因組DNA測序的完成使得枯草芽孢桿菌基因工程的工作的到了迅速發(fā)展?？莶菅挎邨U菌作為繼大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)之后的基因工程菌具有巨大潛力和優(yōu)勢[10]，主要因素有：非致病性，與大腸桿菌相比枯草芽孢桿菌被認為是GRAS生物；枯草芽孢桿菌與大腸桿菌和酵母相比，對培養(yǎng)基的要求成本相對較低；枯草芽孢桿菌沒有明顯的密碼子偏好性，不會出現(xiàn)因表達的外源蛋白含有大量連續(xù)的稀有密碼子而降低蛋白表達量，或者翻譯提前終止等問題[11]；枯草芽孢桿菌在極端條件下可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗逆性很強的內(nèi)源孢子，具有較強的抗逆性；與大腸桿菌相比，較多的外源質(zhì)粒載體(研究者構(gòu)建的各種優(yōu)良載體)可以被轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中；通過實驗和實際生產(chǎn)證明枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)比較穩(wěn)定可靠；枯草芽孢桿菌具有分泌自身胞外蛋白和外源蛋白的功能，所以表達后的外源蛋白可以被簡單的回收和純化；有多種轉(zhuǎn)運機制，能夠在蛋白空間構(gòu)象正確形成后，將外源蛋白被轉(zhuǎn)運到細胞外；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件及代謝過程已經(jīng)被研究透徹，所以能夠很好的控制其發(fā)酵過程，并將枯草芽孢桿菌應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)。

枯草芽孢桿菌啟動子是實現(xiàn)外源基因在枯草芽孢桿菌宿主菌中高效表達的關(guān)鍵因子,啟動子根據(jù)控制轉(zhuǎn)錄水平的高低，可以分為強啟動子和弱啟動子；根據(jù)誘導(dǎo)機制，啟動子又可分為組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、時期特異性啟動子和自誘導(dǎo)啟動子[12]。組成型啟動子在表達時無需受外界的誘導(dǎo)，具有持續(xù)性且大體恒定在一定水平上,枯草芽孢桿菌中應(yīng)用的組成型啟動子有HpaⅡ、lepA、SPO2和P43等，其中以P43應(yīng)用較為廣泛[11]。枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)啟動子有：PamyQ、溫度誘導(dǎo)啟動子、Tet啟動子、IPTG誘導(dǎo)型啟動子、PxylA、Pglv、PspaS、PmanP和PliaI。PamyQ誘導(dǎo)劑為淀粉；Tet啟動子誘導(dǎo)劑為四環(huán)素；IPTG誘導(dǎo)型啟動子包括PgroE、Pspac和Pgrac；PxylA誘導(dǎo)劑為木糖；Pglv誘導(dǎo)劑為麥芽糖；PspaS誘導(dǎo)劑為subtilin；PmanP誘導(dǎo)劑為甘露糖；PliaI誘導(dǎo)劑為桿菌肽。而在枯草芽孢桿菌的基因工程中，常用的化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)有Pspac、Pxyl和PsacB系統(tǒng)等[13-14]。Su-Jin Lee等(2010)將蘇云芽孢桿菌中產(chǎn)Cry(晶體蛋白)的cry3Aa啟動子的-35和-10區(qū)改成與枯草芽孢桿菌σA-依賴性啟動子一致的序列。cry3Aa啟動子的修飾使AprE的產(chǎn)量顯著提高，這表明了該啟動子可能有利于枯草芽孢桿菌蛋白的高效表達[15]。B.R.Belitsky等[16](2015)研究了枯草芽孢桿菌總調(diào)控因子CodY和ScoC之間的相互調(diào)節(jié)作用，ScoC-lacZ融合和DNA結(jié)合試驗表明：ScoC被CodY抑制，產(chǎn)生了級聯(lián)調(diào)節(jié)反應(yīng)；最后研究表明，ScoC的功能會由于其自身表達或與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)而被其它轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控。Yan等[17](2015)發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌類真核蛋白激酶(STPK PrkA)在芽孢形成中的新功能，Hpr(ScoC)對轉(zhuǎn)錄因子σK的表達起抑制作用，而PrkA可以通過抑制Hpr(ScoC)來促進孢子的形成和σK的表達。T.Phanaksri等[18](2015)研究發(fā)現(xiàn)依賴于調(diào)節(jié)因子σB和σA的兩個啟動子的協(xié)同作用可以提高枯草芽孢桿菌中外源基因的表達，這個雙啟動子的協(xié)同效應(yīng)是很保守的，僅在σB-啟動子位于σA-啟動子上游和雙啟動子定位彼此獨立時才出現(xiàn)。

3 枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體的構(gòu)建

枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中質(zhì)粒載體的構(gòu)建也是很關(guān)鍵的一步，研究者需根據(jù)枯草芽孢桿菌宿主菌的不同來選擇合適的表達載體。

目前枯草芽孢桿菌表達載體有整合載體(整合質(zhì)粒)、噬菌體載體和可復(fù)制質(zhì)粒載體三種。采用整合載體攜帶外源基因進入枯草芽孢桿菌表達宿主后，整合載體連同外源基因表達單元進入染色體并隨染色體的復(fù)制而復(fù)制和表達，染色體整合表達的優(yōu)勢是外源基因在宿主中可保持較好的穩(wěn)定性[19]，整合載體依據(jù)其與染色體基因組DNA的同源重組方式不同，可以分為單交叉同源重組載體(single crossover)和雙交叉同源重組載體(double crossover)[12]?？捎糜诳莶菅挎邨U菌表達載體的噬菌體有spp1噬菌體和Ф105噬菌體等，其中Ф105噬菌體應(yīng)用最多，由該噬菌體衍生出的表達載體有Ф105J27和Ф105dcM等[20]?？蓮?fù)制質(zhì)粒也稱為游離質(zhì)?；蚋郊有唾|(zhì)粒，其在宿主中有多個拷貝，所以使用可復(fù)制質(zhì)粒進行表達的優(yōu)勢是目標基因進入宿主的劑量增大，從而有可能使目的基因表達量大大提高。

目前市場上銷售的枯草芽孢桿菌表達質(zhì)粒載體有pWB980、pHT43、pHP13、pHP43、pBE2、pMUTIN4、pUB110、pE194、pMA5、pMK3、pMK4、pHT304、pHY300PLK、pBest502、pDG1363、pSG1154、pAX01、pSAS114、pDL、pDG148-stu、pDG641、pAL12、pUCX05-bgaB、pHT01和pVLT33，其中pVLT33是廣宿主質(zhì)粒；相配套的菌株有Bacillus subtilis 168、WB600、WB700、WB800、WB800N和FZB42等?？茖W(xué)研究中常用的蛋白酶缺陷型菌株有BG2054、DB104、DB105、DB431、WB600、WB700、LB700和WB800[20]。

T.T.Phan等[21](2015)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的IPTG誘導(dǎo)型表達載體Pgrac100(含外源基因)在枯草芽孢桿菌1012中外源基因有較高水平的表達量，而在大腸桿菌中外源基因的表達量卻相對較低，在此載體基礎(chǔ)上，他們還構(gòu)建了Pgrac100-His-tag-MCS載體、Pgrac100-MCS -His-tag載體和Pgrac100-MCS-Strep-tag載體。T.Ogawa等[22](2015)發(fā)明了一種新型的枯草芽孢桿菌基因組BGM載體(誘導(dǎo)recA表達系統(tǒng))——iREX載體，與傳統(tǒng)的BGM載體相比，iREX載體能夠通過抑制錯誤重組體來操縱大片段的DNA，而且iREX載體還能被用來處理許多同源序列(比如多重報告表達框)的DNA，因此，iREX載體作為處理大片段DNA的一個平臺可以擴大BGM載體的利用率。

4 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法

枯草芽孢桿菌是表達外源蛋白的良好宿主菌，如表達蛋白酶、磷脂酶和纖維素酶，因此枯草芽孢桿菌可以被直接應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中。但是很多枯草芽孢桿菌宿主菌因為轉(zhuǎn)化效率低而影響了其應(yīng)用價值。目前質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌的方法有固體培養(yǎng)基法、原生質(zhì)體裂解物固體培養(yǎng)基法(LP轉(zhuǎn)化法)、感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化法(化學(xué)轉(zhuǎn)化法，又稱為Spizizen法)、電轉(zhuǎn)化法(包括電轉(zhuǎn)化完整枯草芽孢桿菌法和甘氨酸處理的電轉(zhuǎn)化法)和原生質(zhì)體法。

早在1958年John Spizizen就研究了枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法，他發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法Spizizen法目前仍被廣泛使用和改進[23]。Zhang等(2011)基于枯草芽孢桿菌SCK6和多聚體質(zhì)粒的重組發(fā)明了一種制備超感受態(tài)細胞的新方法，此法簡單、快速和高效，簡單到只需限制性內(nèi)切酶、磷酸酶和連接酶即可，高效性體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化效率：～107轉(zhuǎn)化子/μg多聚體質(zhì)粒和～104轉(zhuǎn)化子/μg重組質(zhì)粒DNA?？莶菅挎邨U菌超感受態(tài)細胞的制備機制：通過添加木糖誘導(dǎo)感受態(tài)主控調(diào)節(jié)因子ComK的過表達。DNA突變文庫的構(gòu)建需要兩輪PCR：①通過易錯聚合酶鏈反應(yīng)(epPCR)獲得誘變處理的DNA，通過高保真PCR(high-fidelity PCR)獲得線性質(zhì)粒；②第一步的兩種模板DNA進行重疊PCR(overlap PCR)可獲得多聚體質(zhì)粒。此法為Zhang等(2011)年發(fā)明的新方法，通過此新方法不僅提高了蛋白表達水平，還提高了糖苷水解酶家族5內(nèi)切葡聚糖酶再生非晶態(tài)纖維素的特殊活性。DNA突變文庫構(gòu)建的常規(guī)方法比較費時、耗力和成功率低，此新方法簡單、快速和高效。常規(guī)方法和新方法的比較如圖1所示[24]。

A：常規(guī)方法流程 B：新方法流程

枯草芽孢桿菌DB104(枯草芽孢桿菌168的衍生菌株)由于其具有低降解蛋白酶活性和高效的分泌途徑，成為一種很受人關(guān)注的進化宿主菌，但枯草芽孢桿菌DB104也是和其它枯草芽孢桿菌一樣，存在低轉(zhuǎn)化效率(≤103轉(zhuǎn)化子/μg DNA)的缺陷，Vojcic等(2012)經(jīng)過研究獲得了一種較高效率的轉(zhuǎn)化方法，通過在枯草芽孢桿菌感受態(tài)階段改善培養(yǎng)生長條件和組氨酸的濃度、增加感受態(tài)階段的孵育時間和增加轉(zhuǎn)化過程中恢復(fù)階段的孵育時間，使枯草芽孢桿菌DB104的轉(zhuǎn)化效率提高到了～105轉(zhuǎn)化子/μg DNA[25]。

Lu等(2012)通過改善電轉(zhuǎn)化方法的條件分別提高了枯草芽孢桿菌WB800和DB104的轉(zhuǎn)化效率，運用改善后的方法，使得枯草芽孢桿菌WB800的轉(zhuǎn)化效率達到了3.64×105轉(zhuǎn)化子/μg DNA，枯草芽孢桿菌DB104的轉(zhuǎn)化率達到了2.10×105轉(zhuǎn)化子/μg DNA。此轉(zhuǎn)化效率的提高將大大有益于外源基因在枯草芽孢桿菌中的表達、定向進化基因文庫構(gòu)建和野生型枯草芽孢桿菌菌株的轉(zhuǎn)化[26]。

5 枯草芽孢桿菌全基因序列測定及蛋白分泌途徑

目前全基因組序列測序成功的枯草芽孢桿菌有很多，全基因組序列測序的成功為人類研究枯草芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)和功能機制提供了更好的基礎(chǔ)。

最近剛剛公布全基因組序列的枯草芽孢桿菌有：BacillussubtilisATCC 6051a、Bacillussubtilis3NA、BacillussubtilisQB928和Bacillussubtilissubsp.spizizeniiW23等?？莶菅挎邨U菌ATCC 6051a(=KCTC 1028/P31K6)是一種廣泛用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株，具有很高的分泌效率，Kabisch等[27](2015)公布了枯草芽孢桿菌ATCC 6051a的全基因組序列(Accession No.CP011115)，該菌全基因組序列的公布為更好的研究此菌的結(jié)構(gòu)和功能提供了理論依據(jù)。枯草芽孢桿菌ATCC 6051全基因序列和作為外源蛋白表達宿主菌已經(jīng)得到認可，這個野生型菌株與廣泛應(yīng)用于試驗的枯草芽孢桿菌168相比顯示出許多營養(yǎng)缺陷性，比如不可產(chǎn)生聚酮化合物等。但枯草芽孢桿菌ATCC 6051可以通過遺傳學(xué)修飾成為優(yōu)化菌株，在乙偶姻誘導(dǎo)型啟動子控制下表達異源蛋白基因[28]。Reuβ等[29](2015)公布了枯草芽孢桿菌3NA的全基因序列(序列登陸號為：CP010314)，枯草芽孢桿菌3NA在分批補料發(fā)酵時會達到一個高濃度細胞的水平，因此作為一個生產(chǎn)菌株有待于進一步優(yōu)化，優(yōu)化后的枯草芽孢桿菌168和W23基因特性的出現(xiàn)更加表明了枯草芽孢桿菌3NA可以成為一個待優(yōu)化的混合菌株。Yu等[30](2012)完成了枯草芽孢桿菌QB928的全基因組序列測定，并公布在了Genσbank上，序列號為：CP003783?？莶菅挎邨U菌QB928全基因序列的成功測定可被廣泛應(yīng)用在枯草芽孢桿菌遺傳學(xué)研究中。Zeigler(2011)等[31]報道了Bacillussubtilissubsp.spizizeniiW23菌株的全基因序列，此全基因序列的公布強有力地證明了W23是B.subtilisATCC 6633的子代。W23和目前研究的模式菌株B.subtilissubsp.subtilis168同樣擁有3.6Mb的核基因，而且核基因次序都是高度保守的；另外，W23基因組有157個不同于B.subtilissubsp.subtilis168的非核基因片段，而B.subtilissubsp.subtilis168基因組有141個不同于W23的非核基因片段。

枯草芽孢桿菌蛋白分泌是指枯草芽孢桿菌表達的蛋白由細胞膜向細胞外運輸?shù)倪^程?？莶菅挎邨U菌蛋白分泌途徑至少有4種：Sec途徑(此途徑又稱為一般分泌途徑，大多數(shù)細菌分泌蛋白都通過此轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分泌)、Tat途徑(又稱雙精氨酸分泌途徑，因分泌蛋白的信號肽中含有兩個相鄰的精氨酸殘基而得名)、ABC轉(zhuǎn)運子途徑(主要用于細菌素等分子的輸出)和Com分泌途徑(與枯草芽孢桿菌感受態(tài)的形成有關(guān))[32]。

6 枯草芽孢桿菌作為外源基因表達系統(tǒng)存在的問題及解決方法

枯草芽孢桿菌是一種很重要的可以生產(chǎn)高質(zhì)量工業(yè)酶的革蘭氏陽性菌，但運用于工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中有一個很大的障礙：枯草芽孢桿菌自身產(chǎn)生的細胞外蛋白酶可以將外源蛋白降解，這是枯草芽孢桿菌作為外源基因表達系統(tǒng)的最重要缺陷之一。其它缺陷還有：枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)質(zhì)粒不穩(wěn)定，一定程度上存在結(jié)構(gòu)型或分離型上的不穩(wěn)定，在大規(guī)模生產(chǎn)中容易丟失或發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，影響目的蛋白的產(chǎn)率；某些外源基因的表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中會對細胞的生長產(chǎn)生影響；基因?qū)毎a(chǎn)生毒性時，外源蛋白得不到有效表達。

目前已被確定的枯草芽孢桿菌細胞外蛋白酶有中性蛋白酶A、中性蛋白酶B、枯草桿菌蛋白酶(又稱為堿性蛋白酶，包括3種堿性絲氨酸蛋白酶)、金屬蛋白酶和桿菌肽F等?？莶菅挎邨U菌可以產(chǎn)生細胞外蛋白酶并降解外源蛋白已成為事實，為了克服這一障礙，科學(xué)家們通過基因工程手段對枯草芽孢桿菌進行了一些修飾，比如通過基因敲除構(gòu)建缺失某種或幾種細胞外蛋白酶基因的枯草芽孢桿菌菌株；應(yīng)用缺失突變的方法使染色體上相應(yīng)的基因失活，構(gòu)建一個或者多個蛋白酶失活的突變體等。目前構(gòu)建好的缺失細胞外蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株有：WB600菌株、WB700菌株、WB800菌株和WB800N菌株等。WB600菌株是6個蛋白酶失活的突變株，WB700菌株是7個蛋白酶全失活的突變株，當(dāng)外源基因在這些突變株中表達時，既提高了產(chǎn)率又增加了穩(wěn)定性，但這也不是絕對的。Takeko Kodama等(2007)證實在枯草芽孢桿菌后期平穩(wěn)增長階段由于AprX泄露到培養(yǎng)基中(可能是由細胞裂解引起的)造成了異源(外源)蛋白的降解[33]，因此可以構(gòu)建缺失AprX基因的菌株；Rabbani等[34](2014)通過同源重組手段使蛋白酶基因aprE失活，從而獲得了缺失aprE基因活性的Bacillussubtilis168菌株；B.R.Belitsky等[35](2011)通過使用CodY的突變分析和DNaseⅠ足跡實驗的結(jié)合，確定了兩個與CodY有高親和力的結(jié)合位點與ybgE基因控制子有關(guān)。

質(zhì)粒不穩(wěn)定和蛋白酶降解目的蛋白使枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)受到制約，目前的解決方法主要有：①利用多個調(diào)控基因和誘導(dǎo)的方法控制外源基因的表達；②將克隆基因整合到染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，后者是目前克隆枯草芽孢桿菌質(zhì)粒不穩(wěn)定的一種有效途徑[9]；③篩選或構(gòu)建缺陷型蛋白酶菌株。外源基因表達量低的解決辦法有改善宿主菌培養(yǎng)條件和優(yōu)化誘導(dǎo)劑的濃度等。R.F.Li等[36](2015)通過響應(yīng)面的方法來改善重組體CGA-N46在枯草芽孢桿菌DB1342(p-3N46)的表達條件，結(jié)果表明糊精和胰蛋白胨是影響CGA-N46表達的兩個關(guān)鍵因素。CodY是革蘭氏陽性菌的主調(diào)控因子，在枯草芽孢桿菌中，200多個基因包括多肽轉(zhuǎn)運酶、胞內(nèi)蛋白水解酶和氨基酸降解通路都受CodY調(diào)控，但一直以來沒有數(shù)據(jù)顯示CodY能夠調(diào)控胞外蛋白酶，直到G.Barbieri等[37](2015)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CodY與相應(yīng)胞外蛋白酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合時，CodY可以對Vpr和Mpr兩個胞外蛋白酶基因進行負調(diào)控調(diào)節(jié)，因此，目前可以認為CodY是枯草芽孢桿菌全部蛋白有效通路的總調(diào)控因子。

7 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因應(yīng)用及展望

近年來，枯草芽孢桿菌作為轉(zhuǎn)基因表達宿主菌，在分泌外源表達蛋白方面的研究取得了很大的進展，國內(nèi)外已經(jīng)成功表達了多種類型的基因[38]，例如：Z.B.Guan等[39](2015)首次報道了CotA-laccase在枯草芽孢桿菌WB600中的異源表達，并介紹了重組枯草芽孢桿菌WB600-5在細菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)方面具有很大的潛能，而且CotA-laccase-ACS系統(tǒng)也有望應(yīng)用于工業(yè)紡織廢水的生物學(xué)處理中。Q.He[40]等(2015)研究發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌使用內(nèi)蛋白表達系統(tǒng)中可以很好的表達和純化類似抗菌肽cathelicidin-BF的這種溶解性多肽和蛋白。張漫莉等[41](2013)在枯草芽孢桿菌蛋白酶缺失型菌株WB700中成功表達了纖維素酶EGA基因；李靜靜[42](2013)成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌體系誘導(dǎo)表達α-ALDC基因，并比較研究了純酶的酶學(xué)性質(zhì)，優(yōu)化了具有工業(yè)應(yīng)用前景的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因應(yīng)用產(chǎn)品有核苷類產(chǎn)品、核黃素、微生物制劑/益生菌和工業(yè)酶制劑?？莶菅挎邨U菌轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因工程這一領(lǐng)域里已經(jīng)被研究的很成熟了，在質(zhì)粒載體的選擇和改進、轉(zhuǎn)化方法的選擇和優(yōu)化及缺失型蛋白酶菌株的構(gòu)建等方面研究已有很大突破，而且在工業(yè)化生產(chǎn)的實踐應(yīng)用中也取得了很顯著的成績。但還需更加深入的了解芽孢桿菌屬的其它細菌及枯草芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)和功能，從而為枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)基因研究提供更好的理論和研究基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯：李薊龍]

河北北方學(xué)院青年基金項目(No.Q2014028)

武彩霞(1986-)，女，山西大同陽高人，碩士，研究實習(xí)員。

Q 812

C

10.3969/j.issn.1673-1492.2015.05.030

來稿日期：2014-09-01