◎吉仙枝

（三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門(mén)峽472000）

超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝研究

◎吉仙枝

（三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門(mén)峽472000）

以野生山藥為原材料，采用超聲波輔助提取α淀粉酶浸提的方法分別研究了超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度和α淀粉酶浸提階段的α淀粉酶用量對(duì)野生山藥多糖提取效果的影響；并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：各因素對(duì)野生山藥多糖得率的影響次序?yàn)椋撼暪β?超聲時(shí)間>超聲溫度>α淀粉酶用量。最佳參數(shù)組合是：固液比1g：50mL，前期超聲提取階段功率1000W，時(shí)間選定60min,溫度70℃；后期α淀粉酶浸提階段α淀粉酶用量0.2%，酶促反應(yīng)體系溫度60℃，pH為6.0，浸提時(shí)間為30min。按最佳工藝參數(shù)提取，野生山藥多糖得率為11.5%。

野生山藥；多糖；超聲波輔助提取；α淀粉酶

山藥，即薯蕷，別名懷山藥、淮山藥、土薯、山薯、山芋、玉延。多年生蔓型草本植物，根莖圓柱形，直生，長(zhǎng)可達(dá)1米。根莖含淀粉和蛋白質(zhì)，具有營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)、誘生攪擾素、調(diào)度內(nèi)排泄、補(bǔ)氣通脈、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、鎮(zhèn)咳祛痰、平喘等作用，因此，山藥是食藥兩用植物。中國(guó)主產(chǎn)于河南省北部（焦作境內(nèi)，含博愛(ài)、沁陽(yáng)、武陟、溫縣等縣），山東（單縣、蒼山、壽光、兗州、嘉祥、泰安、桓臺(tái)、鄒平等）、河北、山西及中南、西南等地區(qū)也有栽培。

山藥的栽培歷史悠久，普通山藥和田薯是主要的栽培品種。普通山藥中以古代懷慶府（位于河南省焦作境內(nèi)，地域涵蓋沁陽(yáng)、武陟、博愛(ài)、溫縣等）出產(chǎn)的最為著名，習(xí)稱“懷山藥”，外部特征為塊莖較其他山藥小，營(yíng)養(yǎng)豐富。藥理學(xué)研究認(rèn)為，懷山藥不僅營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)，它所富含的山藥多糖能誘生干擾素、活躍機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能、調(diào)整新陳代謝、改善循環(huán)系統(tǒng)功能，其對(duì)于慢性氣管炎、冠心病、心絞痛等均有輔助治療作用。目前，河南焦作的“鐵棍山藥”、山東省菏澤的“陳集山藥”、湖北武穴的“佛手山藥”、江西瑞昌市南陽(yáng)鄉(xiāng)的山藥已申請(qǐng)了國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[1]。本文采用超聲波協(xié)同α淀粉酶輔助提取野生山藥多糖，選用苯酚-硫酸法測(cè)定野生山藥多糖含量，選擇不同超聲頻率、超聲溫度、超聲時(shí)間、α淀粉酶用量等條件展開(kāi)研究。并且在前人研究的基礎(chǔ)上[2][3][4]，將超聲波輔助提取和α淀粉酶浸提分開(kāi)進(jìn)行，使超聲功率的選擇不再受酶活性的限制，很好地提高了野生山藥多糖的提取率，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用野生山藥資源提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器

DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）

722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海天普分析儀器有限公司)

HH-S11-8-S電熱恒溫水浴鍋（金壇市華特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）

FA2204B型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）

高速組織搗碎機(jī)（上海喬躍電子有限公司）

1.1.2 試劑

硫酸、苯酚、無(wú)水氯化鈣和葡萄糖均為分析純?cè)噭?/p>

α淀粉酶（鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司）

本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水

1.1.3 材料

山藥（野生，采挖于河南省修武縣）

1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制

用FA2204B型電子天平稱取分析純干燥恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，配得1mg/ml的葡萄糖儲(chǔ)備液，再用移液管準(zhǔn)確量取10.00ml儲(chǔ)備液后定容至100ml，即得到0.1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 苯酚溶液的配制

取100g無(wú)色針狀的苯酚晶體，90℃水浴中保溫至融化，加入0.05gNaOH進(jìn)行蒸餾提純，取178-182℃的餾出液9.375g加入150ml蒸餾水中，制得26.25%的苯酚溶液，棕色瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 山藥的預(yù)處理

取適量新鮮山藥，洗凈，去皮，切薄片，于電熱恒溫鼓鼓風(fēng)干燥箱中105℃充分烘干并用研缽粉碎。

2.2 山藥多糖的提取

操作流程如下圖所示。

準(zhǔn)確稱取5份已粉碎的山藥樣品2g，置于5個(gè)已加入100ml蒸餾水的錐形瓶中，選擇不同超聲波功率、超聲溫度、超聲時(shí)間和α淀粉酶用量來(lái)分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，離心分離后取出浸提液進(jìn)行水溶性糖含量測(cè)定，進(jìn)行正交分析確定超聲波功率、超聲溫度、超聲時(shí)間和α淀粉酶用量的最佳組合。

超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝流程圖

2.3 山藥多糖含量的測(cè)定方法

采用苯酚-硫酸法。

2.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]

準(zhǔn)確移取0.1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml，分別放置于10ml的比色管中，分別補(bǔ)加蒸餾水至2ml，另取一支比色管直接加蒸餾水至2ml作為空白對(duì)照。在以上比色管中均加入6.25%的苯酚溶液1.0ml，搖勻后各加濃硫酸5.0ml，再次搖勻，冷卻至室溫，490nm可見(jiàn)光處測(cè)量吸光度。根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，得出回歸方程為：A=10.51C（mg/ml）+0.0123,相關(guān)系數(shù)r=0.9991。

2.3.2 測(cè)定野生山藥多糖含量

將2.2操作中，按照不同超聲波功率、超聲溫度、超聲時(shí)間和α淀粉酶用量等參數(shù)條件進(jìn)行的野生山藥提取液，準(zhǔn)確移取0.1ml，分別置入10ml的比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至2ml，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算出不同加熱溫度和時(shí)間水溶性糖的含量[6-7]。

3 結(jié)果與討論

3.1 超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 超聲輔助提取時(shí)超聲功率的選擇

按照2.2操作的方法，因?yàn)檫@里采用了先超聲提取再酶解的方式，不用考慮酶的耐受溫度，故選定超聲提取溫度70℃，提取時(shí)間為50min。之后的α淀粉酶輔助提取階段，α淀粉酶（2000u/g）添加量按照廠家提供的一般使用量加入，同時(shí)加入0.2%無(wú)水氯化鈣（按原料重量計(jì)算），選用該酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，進(jìn)行浸提，使用沸水浴滅活酶，離心分離后取出浸提液進(jìn)行野生山藥多糖含量測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表1。

由表1可知，超聲功率在700W-1100W之間時(shí)，由于超聲波作用于細(xì)胞后，野生山藥多糖溶出率與超聲功率呈現(xiàn)正相關(guān)，隨著超聲功率的增大，多糖得率逐漸提高。但在選擇超聲功率時(shí)，需要考慮到大功率的超聲波會(huì)造成部分多糖的分解等一些負(fù)面影響[8]，結(jié)合數(shù)據(jù)分析，超聲功率大于900W后，對(duì)野生山藥多糖得率的影響沒(méi)有之前明顯。

3.1.2 超聲輔助提取溫度的選擇

按照2.2操作的方法，選定超聲功率為900W，提取時(shí)間為50min。以上幾個(gè)條件不變的情況下，考慮到淀粉的糊化和老化，超聲輔助提取溫度不宜超過(guò)70℃。之后的α淀粉酶輔助提取階段操作與3.1.1同。超聲溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響如表2。

由表2分析可知，由于植物多糖難溶于冷水，在所選定的溫度范圍內(nèi)，開(kāi)始時(shí)隨溫度升高，測(cè)得的野生山藥多糖含量逐步升高，但是溫度升高也伴隨著淀粉的糊化程度增加，當(dāng)溫度大于60℃后，測(cè)得的野生山藥多糖含量增加幅度降低，得率增加值減緩。

表1 超聲功率對(duì)提取效果的影響

表2 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

3.1.3 超聲輔助提取時(shí)間的選擇

按照2.2操作的方法，選定超聲功率為900W，超聲溫度為70℃。之后的α淀粉酶輔助提取階段操作與3.1.1同。以上幾個(gè)條件不變的情況下，超聲輔助提取時(shí)間對(duì)野生山藥多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響如表3。

由表3可知，隨著超聲輔助提取時(shí)間的延長(zhǎng)，所測(cè)得野生山藥多糖含量逐步升高，當(dāng)超聲輔助提取時(shí)間達(dá)到50min后，野生山藥多糖得率的增高趨勢(shì)不明顯，50min至90min的區(qū)段內(nèi)，野生山藥多糖得率基本處于一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值，不再增加。

3.1.4 α淀粉酶用量的選擇

按照2.2操作的方法，超聲輔助提取階段選定為超聲功率900W，提取時(shí)間為50min，提取溫度70℃。結(jié)束后，待溶液溫度降至60℃（α淀粉酶的最適反應(yīng)溫度），將溶液pH調(diào)至6.0（所用的α淀粉酶的最適pH由廠家提供），進(jìn)行時(shí)間為30min的α淀粉酶輔助提取。在其他條件不變的情況下，加入不同量的α淀粉酶（2000u/g）和0.2%無(wú)水氯化鈣（按原料重量計(jì)算）進(jìn)行浸提，按照2.2操作的方法，進(jìn)行野生山藥多糖含量測(cè)定，確定超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝的最佳加酶量。α淀粉酶用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響如表4。

根據(jù)酶促反應(yīng)的特點(diǎn)分析，在反應(yīng)體系中其他成分不變的情況下，酶促反應(yīng)的特定底物與酶的接觸機(jī)會(huì)隨著酶濃度上升而增加，伴隨這個(gè)過(guò)程野生山藥多糖在被分離出來(lái)。但是，當(dāng)酶濃度升高至所有的底物分子都能與酶分子結(jié)合后，酶分子就處于過(guò)飽和狀態(tài)，底物被水解的速度不再與酶分子的增加呈現(xiàn)正相關(guān)。由表4可知，α淀粉酶量低于4mg時(shí)，野生山藥多糖得率隨α淀粉酶用量的增加而增大。當(dāng)加酶量高于4mg后，多糖得率逐漸減小。

3.2 超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝超聲輔助提取階段實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和α淀粉酶用量四個(gè)因素，以野生山藥多糖得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表5，對(duì)超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

由表5的極差分析結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)所選的4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響次序是：超聲功率>超聲時(shí)間>超聲溫度>α淀粉酶用量。超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝的最佳參數(shù)組合為：超聲功率1000W,超聲提取時(shí)間60min,超聲提取溫度70℃,α淀粉酶用量5mg。綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，最終選擇α淀粉酶用量4mg為最佳工藝參數(shù)。按最佳工藝參數(shù)重復(fù)提取，野生山藥多糖得率為11.5%。

表3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

表4 α淀粉酶用量對(duì)提取效果的影響

表5 超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝參數(shù)優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

4 結(jié)論

本研究表明，超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝的最佳參數(shù)組合為：前期超聲提取階段的超聲功率1000W，超聲提取時(shí)間選定60min,超聲提取溫度70℃；后期α淀粉酶浸提階段α淀粉酶用量4mg，酶促反應(yīng)體系溫度60℃，pH為6.0，浸提時(shí)間為30min。這一工藝設(shè)計(jì)將超聲波和α淀粉酶兩個(gè)輔助因素進(jìn)行階段性的分離，回避了超聲功率對(duì)酶活性的不良影響[9]，更好地發(fā)揮了兩者在野生山藥多糖提取過(guò)程中的有利作用，較好地提高了野生山藥多糖的提取率。可見(jiàn)，超聲波協(xié)同α淀粉酶提取野生山藥多糖工藝對(duì)更好地開(kāi)發(fā)野生山藥資源，尤其對(duì)山藥多糖生產(chǎn)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 卞建寧）

TS218

A

1671-9123（2015）01-0140-05

2015-01-17

吉仙枝（1979-），女，河南義馬人，三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院講師。