周婷婷， 仝巧云， 袁晉華

宜昌市中心人民醫(yī)院消化內科，三峽大學消化疾病研究所，宜昌443000

潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜SOCS2、SOCS3的表達及意義＊

周婷婷， 仝巧云△， 袁晉華

宜昌市中心人民醫(yī)院消化內科，三峽大學消化疾病研究所，宜昌443000

目的 研究潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜細胞因子信號轉導抑制子SOCS2、SOCS3的表達，探討其與潰瘍性結腸炎的關系。方法 將30只雄性SD大鼠隨機均分為正常對照組、結腸炎模型組和柳氮磺胺吡啶（SASP）組，采用三硝基苯磺酸（TNBS）誘導制備潰瘍性結腸炎大鼠模型。觀察大鼠一般情況并評價疾病活動指數（DAI），造模7d后處死大鼠，評價其組織學損傷指數（CMDI）及腸黏膜損傷指數（TDI）；采用免疫比濁法檢測血清C-反應蛋白（CRP）濃度；采用RT-PCR及Western blot檢測結腸組織IL-6mRNA、SOCS2、SOCS3mRNA及蛋白的表達。結果 結腸炎模型組DAI、CMDI、TDI評分及CRP水平顯著高于正常對照組，SASP組顯著低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；結腸炎模型組IL-6mRNA、SOCS2和SOCS3mRNA及蛋白表達高于正常對照組（均P＜0.05），SASP組IL-6mRNA、SOCS2、SOCS3mRNA及蛋白表達低于模型組（均P＜0.05）。結論 潰瘍性結腸炎中SOCS2、SOCS3的表達與疾病嚴重程度相關，隨著炎癥程度的加重，SOCS2、SOCS3的表達水平上調。

潰瘍性結腸炎； 三硝基苯磺酸； 柳氮磺胺吡啶； 細胞因子信號轉導抑制子

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的腸道慢性炎癥、潰瘍性疾病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但其發(fā)病機制仍不完全明確，多被認為是一種自身免疫性疾病。細胞因子被認為是參與UC發(fā)病的重要因素之一，JAK-STAT信號途徑是多種細胞因子共同的信號轉導途徑［1］，研究發(fā)現細胞因子信號抑制子（suppressors of cytokine sig－naling，SOCS）家族是JAK／STAT信號途徑的重要負調控因子［2］，但其在UC的表達情況及其與炎癥因子的相關性研究鮮有報道，因此，研究SOCS2／3在UC腸黏膜局部的表達情況及其與腸黏膜炎癥關系，有助于進一步了解UC的發(fā)病機制并為研發(fā)新的治療藥物提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

SPF級雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g，購于三峽大學動物中心［SCXK（鄂）2011-0012］，并在該實驗中心分籠飼養(yǎng)［SYXK（鄂）2011-0061］。主要試劑:三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）購自美國Sigma公司，柳氮磺胺吡啶（SASP）購自上海信誼嘉華藥業(yè)公司，引物由上海生物工程公司合成，抗體購自Santa Cruz生物試劑公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立 將大鼠隨機均分為正常對照組、模型組、SASP組。模型組、SASP組大鼠參照文獻［3］制備大鼠潰瘍性結腸炎模型:禁食24h，棉簽刺激大鼠肛周誘導排便，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3mL／kg），石蠟油潤滑大鼠灌胃針，插入腸道內約8cm，一次性結腸灌注100mg／kg TNBS（與無水乙醇溶液等體積混合），提起尾部倒立3min后，回籠常規(guī)飼養(yǎng)；正常對照組予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌腸。造模第2天起SASP組大鼠予200mg／kg［4］的SASP溶液灌胃，正常對照組、模型組予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。給藥7d后處死大鼠，采集標本。

1.2.2 癥狀、體征觀察及評分 觀察大鼠一般情況。參照文獻［5］進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分評估大鼠一般情況。

1.2.3 結腸黏膜大體形態(tài)損傷評分 處死大鼠，取出結腸，沿腸系膜緣剖開，冰生理鹽水漂洗，肉眼觀察結腸大體損傷情況。參照文獻［6］進行結腸大體形態(tài)損傷評分（colon mucosal damage index，CMDI）。

1.2.4 結腸組織病理學檢查 取大鼠結腸組織，制備石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腸黏膜損傷情況，參照文獻［6］進行結腸組織學損傷指數（tissues damage index，TDI）評分評估結腸黏膜組織學損傷情況。

1.2.5 免疫比濁法檢測血清C-反應蛋白濃度 取血清，采用免疫透射比濁法經生化分析儀測定各組大鼠血清C-反應蛋白（CRP）濃度。

1.2.6 RT-PCR檢測結腸組織IL-6mRNA表達水平 稱取結腸組織100mg，提取總RNA，逆轉錄并PCR擴增，產物凝膠電泳，凝膠成像系統成像，灰度分析。引物序列:IL-6，上游引物5′-GACTGATGTTGTTGACAGCCACTGC-3′，下游引物5′-AGCCACTCCTTCTGTGACTCTAACT-3′（508bp）；GAPDH，上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′（480bp）。RT-PCR反應條件:Mix 5.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1.0μL，加超純水至25μL。反應條件為:94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，共30個循環(huán)；最后72℃5min。

1.2.7 RT-PCR檢測結腸組織SOCS2／3mRNA表達水平 稱取結腸組織100mg，提取總RNA，逆轉錄并PCR擴增，產物凝膠電泳，凝膠成像系統成像，灰度分析。引物序列:SOCS2:上游引物5′-AAGACATCAGCCGGGCCGAC-3′，下游引物5′-TCTTGTTGGTAAAGGTAGTCCC-3′，300bp；SOCS3:上游引物5′-ATGGTCACCCACAGCAAGTTTC-3′，下游引物5′-CGCCCCCAGAATAGATGTAGTAG-3′，514bp。RT-PCR反應條件:Mix 5.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1.0μL，加超純水至25μL。反應條件為:94℃5min，94℃30s，54℃30 s，72℃30s，共30個循環(huán)；最后72℃5min。

1.2.8 Western blot檢測結腸組織SOCS2／3蛋白表達水平 稱取組織約100mg剪碎，加細胞裂解液（含PMSF）1mL于冰上反復研磨，吸取勻漿液，4℃離心12 000r／min×5min，取上清制樣。BCA法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉液封閉2h，一抗4℃靜止過夜，洗滌10min×3，加二抗，室溫搖床孵育50min，洗滌10min×3，ECL化學發(fā)光顯影，灰度分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

正常對照組大鼠活動正常，反應機敏，體毛光澤，大鼠體重增加，糞便成形。大鼠造模第2天出現不同程度的精神萎靡、懶動、厭食表現，體毛失去光澤且雜亂，活動和進食明顯減少，并出現不同程度的血便、黏液便，體重下降，實驗過程中死亡2只。SASP干預后大鼠一般情況好轉，大便逐漸恢復成形，未觀察到明顯黏液膿血便。對各組進行癥狀及體征評分，結果見表1。

2.2 結腸大體形態(tài)損傷評分

正常對照組大鼠結腸未見充血、水腫、擴張，黏膜未見充血、糜爛及潰瘍。模型組大鼠可見部分腸管擴張，腸壁水腫，皺褶消失，腸黏膜充血、潰瘍及污穢苔附著。SASP組大鼠結腸病變明顯減輕，無明顯水腫擴張，腸黏膜局部可見充血水腫，未見明顯糜爛、潰瘍。模型組大鼠結腸大體形態(tài)評分顯著高于正常對照組（P＜0.01），SASP組較模型組顯著下降（P＜0.01）（表1）。

2.3 結腸組織病理學評分

鏡下觀察正常對照組大鼠結腸組織形態(tài)正常，結構清晰，黏膜無壞死脫落，未見明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠結腸組織可見黏膜水腫，部分腸黏膜壞死脫落，杯狀細胞減少，大量炎性細胞浸潤，腺體結構紊亂，可見隱窩膿腫形成。SASP組大鼠結腸組織病變明顯減輕，潰瘍愈合，隱窩膿腫消失，炎性細胞浸潤明顯減少。模型組大鼠結腸組織病理學評分顯著高于正常對照組（P＜0.01），SASP組較模型組顯著下降（P＜0.01），差異有統計學意義（圖1，表1）。

表1 各組大鼠DAI、CMDI、TDI評分（ˉx±s）Table1 Scoring for DAI，CMDI and TDI in rats in each group（ˉx±s）

圖1 各組大鼠結腸組織病理切片（蘇木精-伊紅染色，×100）Fig.1 Histopathological changes of colon tissues of rats in each group（HE staining，×100）

2.4 血清CRP濃度測定

與正常對照組相比，結腸炎模型組的大鼠血清CRP的水平顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，SASP組大鼠血清CRP水平顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠血清CRP濃度（ˉx±s，mg／L）Table2 Serum CRP levels in rats in each group（ˉx±s，mg／L）

2.5 結腸組織IL-6 mRNA表達水平

模型組大鼠結腸組織IL-6mRNA表達高于正常對照組（P＜0.01），與模型組比較，SASP組IL-6 mRNA表達明顯下降（P＜0.05），見圖2、表3。

2.6 結腸組織SOCS2、SOCS3表達

模型組大鼠結腸組織SOCS2、SOCS3mRNA和蛋白表達水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，SASP組大鼠結腸組織SOCS2、SOCS3mRNA和蛋白表達水平下降（P＜0.01，P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 各組大鼠結腸組織IL－6mRNA、SOCS2／3mRNA及蛋白表達Fig.2 Expressions of IL-6mRNA and SOCS2／3mRNA and protein in colonic tissues of rats in each group

表3 各組大鼠IL-6mRNA、SOCS2／3mRNA和蛋白表達水平（ˉx±s）Table3 Expression levels of IL－6mRNA and SOCS2／3mRNA and protein in colonic tissue of rats in each group（ˉx±s）

3 討論

本實驗采用TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎模型模擬UC的發(fā)病，結果顯示，模型組中結腸組織炎癥損傷明顯。CRP作為反映炎癥程度的一個經典指標，其在模型組中的表達是明顯升高的，而在藥物治療后表達水平明顯下降；IL-6是近年來公認為的重要的促炎癥因子，其在腸組織中mRNA水平與CRP表達趨勢一致；SOCS2和SOCS3的表達水平明顯高于正常對照組，給予SASP治療后，腸黏膜炎癥好轉，同時SOCS2、SOCS3的表達水平均下降，提示在正常情況下和結腸炎癥存在的情況下，細胞因子信號的負調控可能存在差異。

細胞因子信號抑制物（SOCS）家族［7－10］，也稱CIS或SSI家族，是近年來發(fā)現的新基因，是細胞因子與受體結合后通過JAK／STAT途徑激活的靶基因產物，目前發(fā)現SOCS1～SOCS7及CIS1等8種蛋白組成。STAT激活誘導SOCS表達，表達的SOCS又以負反饋的形式，通過抑制JAK激酶與細胞因子受體結合的活性，以及促進蛋白酶體水解JAK、STAT蛋白等途徑，抑制JAK／STAT信號通路的活化，對JAK／STAT途徑進行負反饋調節(jié)。Dai等［11］研究發(fā)現，通過上調SOCS3的表達，可以抑制LPS誘導的TNF-α的產生，從而產生抗炎作用。但關于SOCS3的研究也有相反的結論，有學者研究發(fā)現對巨噬細胞給予LPS刺激后，可誘導SOCS3的表達上調，而沉默SOCS3基因后發(fā)現，LPS誘導產生的IL-6、TNF-α顯著下降［12］，提示SOCS3并不是單純的細胞因子信號抑制物，其在某些情況下并不是發(fā)揮著負向調控作用。在本次實驗中，發(fā)現結腸炎模型組中SOCS3的表達水平最高，并且與疾病的嚴重程度一致，而且在經過治療炎癥緩解后，SOCS3的表達水平下降，這與Chaves de Souza等［13］的SOCS3表達水平與疾病嚴重程度相關的報道一致。關于SOCS2，既往認為SOCS2對生長激素／胰島素樣生長因子-1軸（GH／IGF-1）具有刺激作用，并認為其與腸黏膜的修復有關。目前有學者報道在Toll樣受體4介導的炎癥信號通路中通過誘導內源性Ⅰ型IFN的產生可間接促進SOCS2的遲發(fā)型表達［14］。在本次實驗中發(fā)現，結腸炎模型組中SOCS2的表達也是上調的，藥物治療組表達顯著下調，提示SOCS2的表達與機體有無炎癥相關。SOCS2在炎癥反應中究竟發(fā)揮著什么作用尚不清楚，有學者認為SOCS2在人單核細胞接受LPS刺激后向樹突狀細胞轉化及成熟過程中發(fā)揮著重要的作用［15］，而且沉默SOCS2基因后可顯著下調IL-6、TNF-αmRNA的表達水平，提示SOCS2參與了炎癥反應中抗原呈遞細胞的成熟及炎癥因子的轉錄，藥物治療組中SOCS2表達水平的下調可能與炎癥減輕及炎癥細胞的數量減少有關。

本研究初步觀察了SOCS2／3在UC腸黏膜局部的表達情況，SOCS作為炎癥信號通路的抑制因子，隨著炎癥程度的加深而呈適應性增高，起到負向調控炎性因子，抑制炎癥的作用。一旦炎癥得以控制，其表達將逐步回歸正常。所以，對于難治性UC，探索作用于SOCS靶點的藥物，通過上調其表達以達到抑制炎癥進展的目的，可能為UC的治療提供一個新的策略。同時，由于SOCS的異常甲基化導致SOCS水平的降低和腫瘤的發(fā)生有一定關系，所以SOCS還可能作為治療腸道炎癥和腫瘤的新靶標。SOCS參與細胞因子信號通路的調控涉及多種因素，其在UC中的作用機制還有待進一步研究。

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（2015-01-13 收稿）

Expressions of SOCS2 and SOCS3 in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis

Zhou Tingting，Tong Qiaoyun△，Yuan Jinhua
Department of Gastroenterology，Yichang Central People’s Hospital，Institute of Digestive Disease of China Three Gorges University，Yichang 443000，China

Objective To investigate the expressions of suppressors of cytokine signaling 2（SOCS2）and 3（SOCS3）in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis.Methods Thirty healthy male Sprague-Dawley rats were divided into normal control group（group A，n＝10），2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）-induced ulcerative colitis group（group B，n＝10）and sulfasalazine（SASP）-treated group（group C，n＝10）.Rats in group B and group C were induced with TNBS／ethanol enema，and general conditions and disease activity index（DAI）of all rats were observed.After 7days of administration with gastric perfusion，all rats were executed to evaluate tissues damage index（TDI）and colonic mucosa damage index（CMDI）；The concentrations of plasma C-reaction protein（CRP）were determined by immunoturbdimetry and the mRNA expressions of IL-6，SOCS2and SOCS3in colonic tissues were assayed by means of reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）and the protein expressions of SOCS2and SOCS3by Western blot.Results The DAI，TDI，CMDI and the concentrations of CRP were significantly increased in group B while compared with group A.Those were decreased in group C compared with group B（P＜0.01）.The expressions of IL-6mRNA，SOCS2and SOCS3mRNA and proteins were significantly increased in group B as compared with group A（P＜0.05），while those were declined in group C relative to group B（P＜0.05）.Conclusion SOCS2／3expressions were associated with the disease degree in ulcerative colitis，and they were up-regulated with the inflammation aggravation.

ulcerative colitis； trinitrobenzene sulfonic acid； sulfasalazine； suppressors of cytokine signaling

R574.1

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.009

＊湖北省自然科學基金資助項目（No.2013-CFB-388）

周婷婷，女，1987年生，碩士研究生，E-mail:ycztthappy＠163.com△通訊作者，Corresponding author，E-mail:tongqy0904＠163.com