王方超， 陳 明， 郝德雄

2-APB體內(nèi)干預(yù)對壓力超負(fù)荷大鼠左心室心肌肥厚的影響＊

王方超， 陳 明△， 郝德雄

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016

目的 探討瞬時(shí)受體通道C亞族1型（TRPC1）阻滯劑2-APB體內(nèi)干預(yù)對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠左心室心肌肥厚的影響。方法 成年雄性SD大鼠18只，體重200～250g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、AAC組和AAC＋2-APB組（各6只），通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)（AAC）建立壓力超負(fù)荷模型。術(shù)后AAC＋2-APB組大鼠每2天給予2-APB腹腔注射（2.5 mg／kg），共4周。4周后檢測各組大鼠血壓、左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）、左心室心肌細(xì)胞橫徑（LVTDM）；采用免疫組化、Western blot和RT-PCR檢測TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠的LVMI為（1.82±0.09）mg／g，LVTDM為（13.98±0.16）μm。與假手術(shù)組相比，AAC組大鼠LVMI［（2.93±0.23）mg／g］、LVTDM［（20.89±0.79）μm］及TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加（均P＜0.05）；AAC＋2-APB組大鼠LVTDM［（16.12±0.50）μm］、TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），LVMI［（1.99±0.09）mg／g］差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AAC組相比，AAC＋2-APB組大鼠LVMI、LVTDM及TRPC1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著減少（均P＜0.05）。結(jié)論 TRPC1在壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的SD大鼠左心室心肌肥厚中表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)2-APB干預(yù)可降低TRPC1表達(dá)，一定程度上延緩左心室心肌肥厚的進(jìn)展。

瞬時(shí)受體通道C亞族1型； 心肌肥厚； 腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)； 2-APB

心力衰竭是導(dǎo)致心血管病患者死亡的重要因素，心肌肥厚是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，阻止和逆轉(zhuǎn)左室心肌肥厚是防治心力衰竭的關(guān)鍵。瞬時(shí)受體通道C亞族（transient receptor potential channel，TRPC）近年來因其參與心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的調(diào)控過程而廣受關(guān)注［1－2］，瞬時(shí)受體通道C亞族1型（TRPC1）被認(rèn)為是鈣庫操縱性鈣離子通道（storeoperated Ca2＋channels，SOC）的重要組成部分［3］，但目前通過體內(nèi)藥物干預(yù)TRPC1通道對心肌肥厚影響的研究尚少。本研究擬構(gòu)建壓力超負(fù)荷大鼠模型，檢測TRPC1在心肌肥厚過程中的表達(dá)水平，觀察體內(nèi)藥物干預(yù)下調(diào)TRPC1表達(dá)對心肌肥厚進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

2-APB（美國Sigma公司），TRPC1一抗、二抗（英國Abcam公司），SDS-PAGE凝膠配置試劑、BCA試劑盒、ECL試劑盒（碧云天公司），PVDF膜（Millipor公司），總RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］，凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀（美國BIO-RAD公司），大鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓計(jì)（RBP-1型，淮北正華生物儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 成年雄性SD大鼠18只，體重200～250g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為假手術(shù)組、AAC組和AAC＋2-APB組（每組6只）。以腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)（abdominal aorta constriction，AAC）建立壓力超負(fù)荷模型。術(shù)前禁食12h，測尾動(dòng)脈壓力。用10%的水合氯醛0.3mL／100g腹腔注射麻醉，劍突下正中切口切開腹部，分離腹主動(dòng)脈，在右腎動(dòng)脈上方約0.3cm處用4號縫線將7號針頭和腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，拔出針頭，腹腔滴入青霉素（40U），逐層關(guān)腹縫合。假手術(shù)組不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，余同手術(shù)組。AAC＋2-APB組術(shù)后即給予2-APB腹腔注射（2.5mg／kg），每2天1次，持續(xù)4周，假手術(shù)組和AAC組腹腔注射等體積的2%二甲基亞砜作為對照。術(shù)后第2、第4周末測量大鼠尾動(dòng)脈壓力。

1.2.2 左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index，LVMI）的測量 術(shù)后第4周末，禁食12h，測量大鼠尾動(dòng)脈壓力并稱取體質(zhì)量。3組大鼠全身麻醉后打開胸腔，迅速剪取完整心臟，放入預(yù)冷PBS液中，冰上低溫迅速分離出左心室及室間隔稱重。取左心室和室間隔質(zhì)量之和與大鼠體質(zhì)量之比得到LVMI。

1.2.3 左心室心肌細(xì)胞橫徑（left ventricular transdiameter，LVTDM）的測量 取大鼠左心室中部石蠟包埋連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色。隨機(jī)選取20個(gè)形狀較規(guī)則細(xì)胞，測量其細(xì)胞橫徑，取平均值作為LVTDM。

1.2.4 TRPC1的免疫組化檢測 各組切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、H2O2溶液孵育、封閉，TRPC1一抗（1∶200）4℃過夜，滴加生物素化兔二抗，DAB顯色、蘇木精復(fù)染、烘干、封片。高倍鏡下采集圖像，Image Pro-Plus6.0軟件測定陽性表達(dá)的平均吸光度值。

1.2.5 RT-PCR檢測心肌細(xì)胞TRPC1的表達(dá)使用總RNA提取試劑盒提取心肌細(xì)胞總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以其為模板，β-actin為內(nèi)參，引物序列如下:TRPC1上游5′-TATGGGGAAGAACTGCAGTCC-3′，下游5′-CAGATCTTGGCGCAGTTCATT-3′。β-actin上游5′-CAACTGGGACGAATGGAGAA-3′，下游5′-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。PCR條件為: 94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。β-actin基因的退火溫度為60℃，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，余同TRPC1基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增之后行瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，運(yùn)用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 Western blot檢測TRPC1的蛋白表達(dá) 從各組標(biāo)本提取心肌細(xì)胞膜蛋白，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（稀釋倍數(shù)TRPC1為1∶ 2 000，β-actin為1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，二抗（稀釋倍數(shù)1∶1 000）37℃孵育2 h，洗膜3次，顯影。凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx± s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和尾動(dòng)脈收縮壓

與假手術(shù)組相比，AAC組、AAC＋2-APB組大鼠術(shù)后4周末體質(zhì)量顯著降低（均P＜0.05），大鼠尾動(dòng)脈收縮壓顯著升高（均P＜0.05）。與AAC組相比AAC＋2-APB組大鼠體質(zhì)量及尾動(dòng)脈收縮壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后4周末的體質(zhì)量和尾動(dòng)脈收縮壓（ˉx±s）Table1 Body mass and systolic blood pressure（SBP）of the caudal artery in each group at the end of 4weeks after surgery（ˉx±s）

2.2 各組大鼠LVMI和LVTDM

各組標(biāo)本蘇木精-伊紅染色如圖1所示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，間隙均勻；AAC組心肌細(xì)胞明顯肥大，單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少；AAC＋2-APB組細(xì)胞體積較AAC組小，排列較為整齊。各組LV-MI和LVTDM結(jié)果如表2所示，與假手術(shù)組相比，AAC組LVMI、LVTDM顯著增加（均P＜0.05）；AAC＋2-APB組較假手術(shù)組LVTDM明顯增加（P＜0.05），但LVMI無顯著差異；與AAC組比較，AAC＋2-APB組LVMI和LVTDM均顯著降低（均P＜0.05）。

圖1 各組大鼠術(shù)后4周末左心室心肌組織蘇木精-伊紅染色（×400）Fig.1 HE staining of left ventricular myocardial tissues in each group at the end of 4weeks after surgery（×400）

表2 各組大鼠術(shù)后4周末的LVMI和LVTDM（ˉx±s）Table2 LVMI and LVTDM in each group at the end of 4weeks after surgery（ˉx±s）

2.3 TRPC1的免疫組織化學(xué)檢測

各組TRPC1免疫組化檢測結(jié)果如圖2所示，其中棕黃色顆粒為TRPC1蛋白表達(dá)。Image Pro-Plus6.0軟件對各組TRPC1蛋白表達(dá)的吸光度值分析顯示:與假手術(shù)組相比，AAC組和AAC＋2-APB組TRPC1蛋白表達(dá)明顯增加（均P＜0.05）；AAC＋2-APB組TRPC1表達(dá)較AAC組顯著降低（P＜0.05）。見表3。

圖2 各組大鼠術(shù)后4周末左心室心肌組織TRPC1蛋白免疫組化染色（×400）Fig.2 Immunohistochemical analysis of the expression of TRPC1protein in left ventricular myocardial tissues in each group at the end of 4weeks after surgery（×400）

表3 各組大鼠術(shù)后4周末左心室心肌組織TRPC1蛋白免疫組化染色吸光度值（ˉx±s）Table3 Immunohistochemical analysis of absorbance value of TRPC1protein in left ventricular myocardial tissue in each group at the end of 4weeks after surgery（ˉx±s）

2.4 TRPC1的mRNA表達(dá)

如圖3示，與假手術(shù)組比較，AAC組和AAC＋2-APB組TRPC1的mRNA表達(dá)顯著增高（均P＜0.05）；與AAC組比較，AAC＋2-APB組TRPC1的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

2.5 TRPC1的免疫印跡檢測

如圖4示，與假手術(shù)組比較，AAC組和AAC＋2-APB組大鼠TRPC1蛋白表達(dá)顯著增加（均P＜0.05）；與AAC組比較，AAC＋2-APB組大鼠TR-PC1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠術(shù)后4周末左心室心肌組織TRPC1mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of TRPC1mRNA in left ventricular myocardial tissues in each group at the end of 4weeks after surgery

圖4 各組大鼠術(shù)后4周末左心室心肌組織TRPC1蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of TRPC1protein in left ventricular myocardial tissues at the end of 4weeks after surgery in each group

3 討論

左心室肥厚是心肌對壓力負(fù)荷增加的一種適應(yīng)，是多種病理刺激的最終反應(yīng)，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加是導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的基本信號。瞬時(shí)受體通道是位于細(xì)胞膜上的一類重要的鈣離子內(nèi)流通道，TRPC是其中的一個(gè)亞家族，包括TRPC1～7七個(gè)亞型，其中TRPC2在人類細(xì)胞上暫未被發(fā)現(xiàn)［4］。近來大量研究表明，TRPC作為一種非電壓依賴的鈣離子通道，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，參與并調(diào)節(jié)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程［1－2，5］。

TRPC通道的激活受滲透壓、pH值、機(jī)械刺激等多種因素的綜合調(diào)節(jié)，目前大多數(shù)認(rèn)為磷脂酶C（PLC）途徑的激活是其主要機(jī)制。激動(dòng)劑如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ和兒茶酚胺等物質(zhì)和G蛋白耦聯(lián)受體或酪氨酸受體結(jié)合后，激活PLC，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解，產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3）和二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）。之后根據(jù)激活通道刺激物的不同，TR-PC分為受體操縱性鈣離子通道（receptor-operated Ca2＋channels，ROC）和鈣庫操縱性鈣離子通道（SOC）。IP3作用于IP3受體，使肌漿網(wǎng)鈣庫大量釋放Ca2＋，細(xì)胞內(nèi)鈣庫耗竭進(jìn)而激活SOC引起Ca2＋內(nèi)流［6－7］。TRPC1是TRPC的一個(gè)亞型，目前被認(rèn)為是SOC非常重要的組成部分。

目前許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)TRPC1通道的表達(dá)和活性上調(diào)可導(dǎo)致病理性心肌肥厚。2007年，Ohba等［3］發(fā)現(xiàn)在腹主動(dòng)脈縮窄的Wistar大鼠心臟中，TRPC1表達(dá)顯著增加；以小干擾RNA（siRNA）下調(diào)TRPC1基因表達(dá)，結(jié)果顯示內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ和去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚并不明顯。2009年，Seth等［8］研究證實(shí)TRPC1基因缺失的WT大鼠在受到壓力負(fù)荷或神經(jīng)激素刺激的作用下，心肌肥厚并不顯著。2010年，Vindis等［9］發(fā)現(xiàn)5-羥色胺處理大鼠心肌細(xì)胞可使TRPC1表達(dá)明顯上調(diào)，使用siRNA下調(diào)TRPC1基因表達(dá)，同樣有效抑制了心肌肥厚進(jìn)展。

當(dāng)前有關(guān)TRPC1的研究多為體外研究，通過藥物抑制TRPC1表達(dá)進(jìn)而觀察心肌肥厚進(jìn)展的研究更少。本實(shí)驗(yàn)選用TRPC1阻滯劑2-APB，采用腹腔注射的方式進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，通過觀察比較心肌肥厚指標(biāo)的變化，進(jìn)一步探討TRPC1在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，AAC術(shù)后，AAC組和AAC＋2-APB組大鼠與假手術(shù)組比較，尾動(dòng)脈壓力明顯升高，提示AAC模型構(gòu)建成功。術(shù)后4周，與假手術(shù)組比較，AAC組大鼠LVMI和LVTMD均顯著增加，TRPC1mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，提示壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠肥厚心肌細(xì)胞中TRPC1的表達(dá)上調(diào)。與AAC組比較，AAC＋2-APB組大鼠LVMI、LVTDM均顯著減小，TRPC1蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)，提示通過體內(nèi)藥物干預(yù)下調(diào)TRPC1的表達(dá)可抑制心肌肥厚的進(jìn)展。另外，在本實(shí)驗(yàn)中觀察到，與假手術(shù)組比較，AAC＋2-APB組除LVMI無顯著差異外，LVTDM、TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，提示2-APB使用4周在分子和細(xì)胞水平抑制作用已非常顯著。加大2-APB劑量或延長使用時(shí)間是否可進(jìn)一步顯著降低LVMI，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。

本實(shí)驗(yàn)亦有不足之處，2-APB（2-Aminoethoxydiphenyl borate）是一種膜通透性的IP3受體（IP3R）拮抗劑，可抑制鈣庫誘導(dǎo)的鈣庫調(diào)控性離子通道（SOC）活化［10］。但2-APB并非TRPC1的特異性阻滯劑，在抑制TRPC1的同時(shí)可能也抑制了其他心肌肥厚發(fā)生相關(guān)通道的激活。另外，由于使用2-APB進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)尚少，目前并無明確的劑量選擇標(biāo)準(zhǔn)，本研究劑量的選擇參考國內(nèi)李燕等［11］的研究，其相關(guān)的毒副作用尚缺乏參考資料。再者，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)并未采用心臟多普勒超聲或心腔內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)檢測進(jìn)一步評估心肌肥厚進(jìn)展程度?？傊?，TRPC1作為TRPC通道的一個(gè)亞型，作為SOC的重要組成部分，在壓力超負(fù)荷大鼠左室心肌肥厚的進(jìn)展中具有重要作用，未來是否可選用TRPC1特異性阻滯劑來延緩甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的進(jìn)展，尚需更深入的研究。

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（2014-06-05 收稿）

Effect of In Vivo 2-APB Intervention on Left Ventricular Hypertrophy Induced by Pressure Overload

Wang Fangchao，Chen Ming△，Hao Dexiong
Department of Cardiology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Objective To investigate the effect of in vivo intervention with the transient receptor potential channel 1（TRPC1）inhibitor 2-APB on left ventricular hypertrophy induced by pressure overload in SD rats.Methods Eighteen adult male SD rats，weighing 200－250g，were randomly divided in sham-operated group，abdominal aorta constriction（AAC）group and AAC＋2-APB group（n＝6in each group）.Pressure overload model was created by AAC.Rats in AAC＋2-APB group were given 2-APB（2.5mg／kg）by intraperitoneal injection once every 2days.After administration for 4weeks，blood pressure，left ventricular mass index（LVMI）and transverse diameter of left ventricular myocytes（LVTDM）were measured.The expression levels of TRPC1mRNA and protein were detected by immunohistochemistry，RT-PCR and Western blot，respectively.Results The LVMI［（2.93±0.23）mg／g vs.（1.82±0.09）mg／g］，LVTDM［（20.89±0.79）μmvs.（13.98±0.16）μm］，expression levels of TRPC1mRNA and protein were significantly higher in AAC group than in sham-operated group（P＜0.05for all）.Compared with sham-operated group，the LVTDM［（16.12±0.50）μm］，and expression levels of TRPC1mRNA and protein were profoundly increased in AAC＋2-APB group（P＜0.05），while LVMI［（1.99±0.09）mg／g］was not significantly different between the two groups.These indexes were significantly decreased in AAC＋2-APB group when compared with AAC group（P＜0.05）.Conclusion TRPC1was upregulated in rats with left ventricular hypertrophy induced by pressure overload.In vivo 2-APB intervention could downregulate the expression of TRPC1and delay the progress of left ventricular myocardial hypertrophy.

transient receptor potential channel 1； ventricular hypertrophy； abdominal aorta constriction； 2-aminoethoxydiphenyl borate（2-APB）

R364.31

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.007

＊國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)資助項(xiàng)目（No.財(cái)社［2011］170號）

王方超，男，1988年生，碩士研究生，E-mail:fangchao.07＠163.com△通訊作者，Corresponding author，E-mail:chenmingcq＠126.com