盧 藝， 褚曉凡， 黃巧英， 曹 旭， 鄒良玉， 張 瑩

缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞死亡方式與鈉鉀ATP酶活性及NKCC1表達的關(guān)系＊

盧 藝， 褚曉凡， 黃巧英， 曹 旭， 鄒良玉， 張 瑩

深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518000

目的 通過改良的糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型，探討缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞損傷后的細胞死亡途徑與細胞膜損傷中鈉鉀ATP酶（Na＋-K＋-ATPase）活性及鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運體1（Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1，NKCC1）表達的關(guān)系。方法 取出生24h內(nèi)的SD大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng)，鑒定其純度，應(yīng)用改良的OGD模型，將星形膠質(zhì)細胞進行OGD（0、1、2、3、4、6h）處理后檢測不同時間點細胞的脹亡率、凋亡率、ATP含量、鈉鉀ATP酶的活性及NKCC1的表達水平。結(jié)果 星形膠質(zhì)細胞存活率隨OGD時間的延長而降低，OGD 3h后脹亡細胞率超過凋亡細胞率。ATP含量和鈉鉀ATP酶活性隨OGD時間的延長而下降，NKCC1的表達隨著OGD時間的延長先增加后減少，在OGD 3h后明顯減少。結(jié)論 缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞死亡在OGD 3h內(nèi)以凋亡為主，OGD 3h后脹亡是細胞死亡的主要方式，這種轉(zhuǎn)化或許與Na＋，K＋-ATPase活性及NKCC1表達的激活有關(guān)。

星形膠質(zhì)細胞； 糖氧剝奪模型； 脹亡； 鈉鉀ATP酶； 鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運體1

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞，它們向神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持和代謝底物，調(diào)節(jié)突觸活性，維持神經(jīng)元的功能［1］。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成成分之一，星形膠質(zhì)細胞的死亡方式也逐漸被重視，其死亡方式包括凋亡、脹亡、自噬性細胞死亡等模式，不同的死亡信號途徑可以促發(fā)不同的細胞死亡方式。本課題組前期研究表明，應(yīng)用改良的糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型能模擬缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞損傷，同時缺血缺氧中心區(qū)的星形膠質(zhì)細胞可經(jīng)由凋亡及脹亡兩種途徑走向死亡，而不同缺血缺氧時期其主要的死亡方式亦有所不同［23］。本實驗則從細胞膜離子泵功能及鈉-鉀-氯共轉(zhuǎn)運體1（Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1，NKCC1）表達變化的角度，通過應(yīng)用改良的模擬缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞損傷的糖氧剝奪模型，探討缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞在糖氧剝奪后細胞死亡與細胞膜損傷中的ATP含量、鈉鉀ATP酶（Na＋-K＋-ATPase）活性及NKCC1表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)

無菌條件下取出生24h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠（廣東省實驗動物中心）大腦海馬，剪碎、吹打、過濾，用含10%胎牛血清＋10%小牛血清＋青／鏈雙抗的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為l×106個／mL，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后換液，以后每3天更換培養(yǎng)液1次。傳代純化培養(yǎng)，直至傳代到第3代。第3代星形膠質(zhì)細胞行膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鑒定，細胞純度達95%以上時用于后續(xù)實驗。一般原代細胞培養(yǎng)至第3代需18～21 d，此時正是星形膠質(zhì)細胞缺血缺氧條件下生長曲線的高峰敏感期，因此后續(xù)實驗均使用該期細胞［4］。

1.2 GFAP染色鑒定星形膠質(zhì)細胞

當(dāng)原代培養(yǎng)細胞經(jīng)過純化傳至第3代后，按照GFAP（Sigma，USA）及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（碧云天公司）免疫熒光染色方法進行操作，然后應(yīng)用熒光共聚焦顯微鏡拍照。其中GFAP陽性細胞胞質(zhì)呈明亮的黃、綠色熒光，活細胞的細胞核呈DAPI陽性的藍色熒光。GFAP陽性細胞數(shù)占DAPI陽性細胞數(shù)的百分比即為星形膠質(zhì)細胞的純度，純度＞95%方可用于實驗。

1.3 改良糖氧剝奪模型的建立及分組

鑒定合格及純化的星形膠質(zhì)細胞用PBS清洗3次后，加入適量含有濃度為10mmol／L的連二亞硫酸鈉的無血清無糖DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到預(yù)先充滿混合氣體（10%H2，85%N2和5%CO2）的37℃厭氧培養(yǎng)箱中，進行缺血缺氧培養(yǎng)［2］。將細胞隨機分成對照組（OGD 0h）和糖氧剝奪組，再按持續(xù)糖氧剝奪時間分為OGD（1、2、3、4、6h）組。每組各指標(biāo)獨立重復(fù)檢測4次。

1.4 流式細胞儀檢測細胞脹亡及凋亡

使用默克公司Annexin V-FITC／PI Apoptosis Detection Kit目錄中貨號為PF032的產(chǎn)品，根據(jù)說明書進行標(biāo)記操作后立即用流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）檢測分析。每個樣品計數(shù)5 000個細胞。

1.5 星形膠質(zhì)細胞ATP含量檢測

細胞內(nèi)ATP水平測定選用ATP生物熒光測定試劑盒（Beyotime，中國，目錄號S0026），根據(jù)產(chǎn)品說明書操作。ATP含量單位為nmol／mg蛋白。

1.6 星形膠質(zhì)細胞鈉鉀ATP酶活性檢測

試劑盒購自南京建成生物工程研究所。采用定磷法，利用ATP酶可以催化ATP分解生成ADP和無機磷的原理，通過酶標(biāo)儀（Biotek公司，美國）測定無機磷的生成量來判斷ATP酶活性高低。

1.7 Western blot測定NKCC1表達水平

棄培養(yǎng)液，加入2mL預(yù)冷的PBS，用細胞刮刮下細胞，轉(zhuǎn)移至試管，1 000r／min離心5min，去上清，每管細胞加300μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，于4℃下12 000r／min離心5min，將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5mL的離心管，用BCA蛋白濃度測量法測蛋白濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（南京建成生物公司），90V、1.5h電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST漂洗3次，含有5%脫脂奶粉的TBST常溫封閉1h，一抗孵育過夜。使用1∶1 000NKCC1抗體（Sigma，USA），1∶1 000β-actin抗體（Santa Cruz，USA），一抗孵育完成后TBST漂洗3次，辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗（英韋創(chuàng)津，美國）常溫孵育1h，TBST充分洗滌后以ECL法顯色并拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GFAP熒光染色鑒定星形膠質(zhì)細胞

如圖1所示，DAPI染色中藍紫色為星形膠質(zhì)細胞的細胞核，GFAP染色中黃綠色為星形膠質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)的GFAP，鑒定顯示GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞純度超過95%。

圖1 星形膠質(zhì)細胞熒光染色鑒定（×200）Fig.1 Identification of astrocytes by fluorescent staining（×200）

2.2 各組細胞的存活率、凋亡率及脹亡率比較

采用經(jīng)典的AnnexixⅤ／PI染色流式細胞術(shù)檢測各組細胞死亡率。流式細胞圖左上象限Q1:AnnexinⅤ－／PI＋，為機械損傷和細胞膜基本不存在的壞死細胞；右上象限Q2:AnnexinⅤ＋／PI＋，為早期脹亡細胞；左下象限Q3:AnnexinⅤ－／PI－，為正?；罴毎?；右下象限Q4:AnnexinⅤ＋／PI－，為早期凋亡細胞。圖2、3顯示在不同OGD時間星形膠質(zhì)細胞的主要死亡方式。采用方差分析對各組細胞進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示:OGD 2h脹亡細胞率（8.32 ±0.86）%與凋亡細胞率（9.33±0.87）%相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而OGD 3h脹亡細胞率（9.54±1.47）%超過凋亡細胞率（7.69±0.80）%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示隨OGD的時間延長凋亡細胞率逐漸下降，脹亡細胞率逐漸增高，在OGD 3h后星形膠質(zhì)細胞主要通過脹亡途徑走向死亡。

圖2 AnnexinⅤ／PI流式細胞染色檢測不同OGD時間星形膠質(zhì)細胞的脹亡率和凋亡率Fig.2 AnnexinⅤ／PI flow cytometry analysis of the oncosis rate and the apoptosis rate of astrocytes at different time points of OGD

圖3 不同OGD時間點星形膠質(zhì)細胞的脹亡率和凋亡率Fig.3 The oncosis rate and the apoptosis rate of astrocytes at different time points of OGD

2.3 各組星形膠質(zhì)細胞ATP含量

如圖4所示星形膠質(zhì)細胞ATP含量隨OGD時間的延長而下降，方差分析顯示各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組細胞的Na＋，K＋-ATPase活性

星形膠質(zhì)細胞進行OGD處理1、2、3、4、6h后測定各組細胞的Na＋，K＋-ATPase活性，方差分析顯示，Na＋，K＋-ATPase活性隨OGD時間的延長而下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 星形膠質(zhì)細胞ATP含量隨OGD時間的變化Fig.4 Changes of the ATP content in astrocytes with OGD

圖5 星形膠質(zhì)細胞鈉鉀ATP酶活性隨OGD時間的變化Fig.5 Changes of the activity of Na＋-K＋-ATPase in astrocytes with OGD

2.5 各組細胞的NKCC1表達水平

Western blot結(jié)果顯示，NKCC1的表達隨著OGD時間的延長先增加后減少，在OGD 3h后明顯減少，見圖6。

圖6 Western blot檢測不同OGD時間細胞NKCC1的表達水平Fig.6 Western blot analysis of the expression of NKCC1at different time points of OGD

3 討論

研究認為當(dāng)腦組織缺血缺氧后可以產(chǎn)生腦缺血中心區(qū)及腦缺血半暗帶區(qū)，當(dāng)缺血缺氧時間進一步延長及灌注量進一步下降，腦缺血中心區(qū)的范圍就會向半暗帶區(qū)擴大，引起嚴重的功能障礙［5］。本課題組在前期研究中觀察到大鼠腦組織缺血中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞死亡以脹亡途徑為主，而周邊區(qū)則以凋亡為主；在同一個病灶中，細胞脹亡和凋亡可同時存在且有一定的分布特征，在能量相對充足、血液供應(yīng)相對豐富部位以凋亡多見，而血供貧乏的區(qū)域則細胞脹亡多見。同時褚曉凡等［6－7］在大鼠的MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，鼠缺血缺氧中心區(qū)的星形膠質(zhì)細胞細胞死亡主要是以腫脹、破碎為主的，缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞腫脹、核溶解的形態(tài)與脹亡的形態(tài)學(xué)變化相吻合。脹亡（oncosis），主要表現(xiàn)為受損后的細胞體積擴大，膜完整性破壞、通透性增加，DNA裂解成為非特異性片段，最后細胞溶解，胞質(zhì)漏出并伴有周圍組織炎癥反應(yīng)［8］。

我們在本次實驗中，通過改良型的糖氧剝奪模型能模擬缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞的損傷，使用AnnexinⅤ＋PI雙染方法發(fā)現(xiàn)隨著糖氧剝奪時間的增加，正常存活的細胞越來越少（Q3象限），AnnexinⅤ陽性的細胞比例未見明顯變化（Q4象限），而PI陽性的細胞比例隨著糖氧剝奪時間的增加而上升，這意味著細胞膜通透性改變的細胞比例增加（Q1＋Q2象限），在糖氧剝奪3h時，其細胞比例超過了AnnexinⅤ陽性的細胞比例（圖2、3）。這提示在缺血缺氧中心區(qū)，同時存在著凋亡和脹亡等多種死亡途徑。在糖氧剝奪的開始階段星形膠質(zhì)細胞啟動凋亡死亡途徑來適應(yīng)外界的環(huán)境，在持續(xù)的糖氧剝奪過程中，星形膠質(zhì)細胞的能量進一步耗竭，從而進一步被動地啟動脹亡途徑，并在糖氧剝奪3 h后占據(jù)主導(dǎo)地位，3h也許是凋亡轉(zhuǎn)向脹亡方式的一個時間點。同時另有報道顯示，持續(xù)性的糖氧剝奪會降低細胞內(nèi)的ATP水平，隨著時間的增加呈線性下降，當(dāng)細胞內(nèi)的ATP水平下降至35%以下，星形膠質(zhì)細胞會表現(xiàn)為脹亡的死亡方式，細胞膜通透性改變并釋放大量的炎癥因子［9］。

Na＋，K＋泵衰竭是離子泵功能障礙的主要部分［10］。Na＋，K＋-ATPase是鑲嵌在細胞質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子層中的一種蛋白質(zhì)，具有載體和酶的活性。哺乳動物的細胞中，鈉鉀ATP酶（Na＋，K＋-ATPase）的最基本作用是維持細胞內(nèi)外鈉鉀離子濃度梯度——細胞內(nèi)鉀濃度高，細胞外鈉濃度高。其產(chǎn)生、維持細胞的靜息電位需要消耗ATP。鈉鉀ATP酶需要消耗1個分子ATP才能將3個Na＋逆濃度梯度轉(zhuǎn)運出細胞，同時將2個K＋逆濃度梯度轉(zhuǎn)運入細胞［11－12］。這種離子濃度梯度維持細胞膜正常形態(tài)和細胞容積；維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細胞內(nèi)外鉀離子的正常濃度；并為鈉離子的被動轉(zhuǎn)運提供勢能。Na＋，K＋-ATPase的功能障礙，將引起一系列細胞功能紊亂，如鈣超載、線粒體腫脹、細胞水腫等，繼而導(dǎo)致不可逆的細胞死亡［13］。Na＋，K＋－ATPase所介導(dǎo)的K＋內(nèi)流在L-谷氨酸介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞腫脹中亦起關(guān)鍵作用［14］。

本實驗中星形膠質(zhì)細胞其Na＋，K＋-ATPase活性隨OGD時間的延長而降低，流式細胞儀測得的脹亡細胞率則隨OGD時間的延長而增多，可見脹亡細胞率隨Na＋，K＋-ATPase活性降低而升高。我們的前期研究已發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞的ATP隨OGD時間的延長而逐漸下降，脹亡率明顯升高，在OGD 3h內(nèi)脹亡率小于凋亡率，3h起逐漸超過凋亡率，成為星形膠質(zhì)細胞的主要死亡方式［9］。綜合分析，我們有如下推測:①ATP水平可影響細胞死亡的方式，同一刺激下細胞出現(xiàn)凋亡還是脹亡，取決于ATP的量，如果能量不足，凋亡無法完成其程序，則細胞轉(zhuǎn)向脹亡，這樣通過影響胞內(nèi)ATP水平，從而決定細胞死亡方式。有實驗表明，在補充ATP后，細胞脹亡可轉(zhuǎn)為凋亡形式的死亡［15］?？梢哉J為同樣的OGD刺激，作用時間短主要走凋亡程序，作用時間長主要走脹亡程序。此結(jié)論跟早前其他研究者的結(jié)論一致:細胞凋亡和脹亡可由同一種刺激導(dǎo)致［16］，并且跟刺激強度、作用時間有關(guān)。強度較弱，作用時間較短時，以凋亡為主；相反，刺激強度大，作用時間長，細胞損傷相對嚴重時，則細胞死亡主要以脹亡方式［17］。②缺血缺氧中心區(qū)細胞損傷嚴重，引起細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生明顯減少，由于細胞Na＋，K＋-ATPase的跨膜離子轉(zhuǎn)運需要消耗ATP，當(dāng)ATP不足時Na＋，K＋-ATPase活性降低，導(dǎo)致Na＋通過氧化應(yīng)激激活非選擇性陰離子通道進入細胞，進一步通過鈉鈣交換，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，隨后水在滲透壓的作用下通過自由擴散進入細胞內(nèi)，引起細胞腫脹，同時因為缺乏ATP導(dǎo)致細胞不能完成凋亡這一耗能過程，故進入脹亡途徑。

NKCC1是細胞膜上的固有膜蛋白，在細胞體積調(diào)節(jié)和離子平衡中起到重要作用［18－19］。它通過Na＋，K＋-ATPase建立起來的細胞內(nèi)外的Na＋濃度梯度勢能，以1∶1∶2的比例將Na＋、K＋、Cl－轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，然而由于Na＋、K＋可以很快地被Na＋，K＋-ATPase轉(zhuǎn)運出入細胞。而NKCC1協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白對離子轉(zhuǎn)運的同時，伴隨著水進入細胞，且細胞體積的增加大約發(fā)生于細胞外K＋濃度增加后的2.6s。同時NKCC1可以對抗細胞外的滲透壓，將水分子轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)，從而進一步導(dǎo)致細胞的腫脹［20］。由于NKCC1的活動是繼發(fā)性主動轉(zhuǎn)運，它需要Na＋，K＋-ATPase建立起來的細胞內(nèi)外溶質(zhì)滲透梯度供給能量，NKCC1作為一種細胞上的固有膜蛋白，在腦缺血早期階段是細胞外的高K＋環(huán)境，NKCC1可以承載Na＋、K＋、Cl－和水進入細胞內(nèi)，造成神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞毒性腦水腫，因此NKCC1主要在缺血的早期階段和再灌注階段對缺血性腦水腫的形成起到作用［21］。我們的實驗也發(fā)現(xiàn)，在模擬缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞損傷的過程中，NKCC1的表達隨著OGD時間的延長先增加后減少，在OGD 3h后明顯減少。我們推測有如下原因:在缺血缺氧早期，氧自由基增加，可以使得培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的NKCC1發(fā)生氧化作用和硝化作用，從而增強NKCC1的活性及表達量［22］。而NKCC1表達增加過程中需要消耗更多Na＋，K＋-ATPase建立起來的細胞內(nèi)外溶質(zhì)滲透梯度供給能量，因此隨著缺血缺氧時間的延長NKCC1的表達量會逐漸減少，同時腫脹的細胞也會進一步破碎，走向壞死結(jié)局。

通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)不同的糖氧剝奪時期，缺血缺氧中心區(qū)星形膠質(zhì)細胞死亡的主導(dǎo)方式不同，在OGD 3h內(nèi)以凋亡方式為主，而3h后凋亡方式被抑制，星形膠質(zhì)細胞死亡通過激活某些途徑向脹亡方式轉(zhuǎn)化，其中Na＋，K＋-ATPase活性及NKCC1表達的激活也許是其中的某些途徑，這為以后的藥物及相關(guān)機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（2015－03－06 收稿）

Relationship between the Astrocyte Death Pathway in the Ischemic Core
and the Activity of Na＋，K＋-ATPase or the Expression of NKCC1

Lu Yi，Chu Xiaofan，Huang Qiaoying et al
Department of Neurology，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen 518000，China

Objective To study the relationship between the astrocyte death pathway in the ischemic core and the activity of Na＋，K＋-ATPase or the expression of Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1（NKCC1）by using modified oxygen and glucose deprivation（OGD）model.Methods Astrocytes of the newborn SD rats（within 24h）were cultured in vitro and the cell purity identified.The oncosis rate and apoptosis rate of astrocytes，the content of ATP，the activity of Na＋-K＋-ATPase and the expression of NKCC1were detected by use of the modified OGD model after OGD for 0，1，2，3，4or 6h.Results The viability of astrocytes was decreased with the extension of OGD.The oncosis rate was greater than the apoptosis rate after 3hOGD.The content of ATP and the activity of Na＋-K＋-ATPase were decreased with the extension of OGD.The expression of NKCC1was first increased and then decreased with the extension of OGD，and it was significantly reduced after OGD for 3h.Conclusion The main death pathway of astrocytes in the ischemic core is apoptosis within 3hof OGD and becomes oncosis after 3-h OGD，which may be related to the Na＋-K＋-ATPase activity and the NKCC1expression.

astrocytes； oxygen-glucose deprivation model； oncosis； Na＋-K＋-ATPase； Na＋-K＋-2Cl－-cotransporter 1

R364.4

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.005

＊國家自然科學(xué)基金資助項目（No.30971024），廣東省自然科學(xué)基金資助項目（No.9151051501000009）

盧 藝，女，1976年生，主治醫(yī)師，E-mail:1049328794＠qq.com