朱宇雯何曉婕楊 青，2，3△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院生物化學(xué)系 上海 200438；2上海生物制造產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 200237；3上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心 上海 200438）

IDO抑制劑黃連堿對(duì)Aβ與IFN-γ聯(lián)用誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

朱宇雯1何曉婕1楊 青1，2，3△

（1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院生物化學(xué)系 上海 200438；2上海生物制造產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 200237；3上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心 上海 200438）

阿爾茲海默癥（Alzheimer′s disease，AD），又稱原發(fā)性老年癡呆癥，是一種致死性慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要特征包括細(xì)胞外β淀粉樣斑塊（amyloidβ-protein，Aβ）、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元功能紊亂或丟失［1-4］。

吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是肝臟外唯一可催化色氨酸循犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）代謝的限速酶［5］。95%以上通過(guò)飲食攝入的色氨酸進(jìn)入KP，繼而產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的代謝中間體［6-7］。炎性因子IFN-γ能在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)IDO表達(dá)［8］。

KP的異常上調(diào)會(huì)對(duì)周圍組織產(chǎn)生損害，并參與AD的形成［9-11］。在認(rèn)知功能嚴(yán)重受損的AD患者血液中，IDO過(guò)量表達(dá)、犬尿氨酸與色氨酸之比升高、神經(jīng)毒素含量顯著增加［12-13］。Aβ各長(zhǎng)度前體中，Aβ（1-42）的神經(jīng)毒性最強(qiáng)，且能誘導(dǎo)IDO的表達(dá)及引起KP的活化［14-17］。由此可見，IDO的過(guò)表達(dá)和KP途徑的過(guò)度活化可能和AD的發(fā)病機(jī)制有密切聯(lián)系。傳統(tǒng)中藥黃連解毒湯對(duì)AD具有治療作用［18-19］。本課題組曾發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯在體外對(duì)重組人IDO有較強(qiáng)的抑制效果［20］。黃連堿（coptisine）作為黃連解毒湯的重要成分，是優(yōu)良的IDO抑制劑，具有治療AD的潛能［21］。

有關(guān)AD和IDO關(guān)系的研究多集中在巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞上，而使用神經(jīng)元探討IDO與AD關(guān)系的研究少有開展。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）系神經(jīng)嵴源性，常用于神經(jīng)元的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Aβ與IFN-γ聯(lián)用的刺激手段，探討IDO抑制劑黃連堿對(duì)PC12細(xì)胞IDO高表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，以期為IDO與AD關(guān)系及其治療作用提供新線索。

方法

材料和設(shè)備 Aβ1-42單體（上海吉爾生化）；黃連堿（上海經(jīng)科宏達(dá)生物公司）；1-MT、羅丹明123（美國(guó)Sigma公司）；Hoechst、IFN-γ（鼎國(guó)生物技術(shù)公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（美國(guó)Gibco公司）。PCR儀（Bio-rad公司）；722分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）；凝膠成像系統(tǒng)（上海實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠）；熒光顯微鏡（美國(guó)Molecular Devices公司）；熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Bio Tek Instruments公司）；高速離心機(jī)、超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS及0.1%青-鏈霉素）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，1：3傳代。Hoechst熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞，用于凋亡實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞按2×105/孔的密度接種至6孔板中。

RT-PCR檢測(cè) 經(jīng)不同刺激條件或藥物處理的PC12細(xì)胞用Trizol試劑，按說(shuō)明書所述操作方法抽提總RNA后，進(jìn)行紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量，以1μg RNA進(jìn)行RT反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如表1所示。PCR條件為：96℃預(yù)變性3 min，96℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延長(zhǎng)1 min，反應(yīng)循環(huán)22次，72℃延伸5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照。

real-time PCR檢測(cè) 取1μg總RNA進(jìn)行RT反應(yīng)，用SYBER Green法對(duì)目的基因相對(duì)定量，GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如表1所示。PCR條件為：96℃預(yù)變性5 min，96℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延長(zhǎng)1 min，反應(yīng)循環(huán)35次。數(shù)據(jù)采用MyIQ軟件分析。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

Hoechst熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按實(shí)驗(yàn)要求給各組細(xì)胞加刺激條件或給藥后，4%多聚賴氨酸固定10 min。PBS洗滌后，用Hoechst 33342染料對(duì)各組細(xì)胞染色。PBS洗滌后，在熒光顯微鏡紫色濾光器下觀察細(xì)胞核大小、形態(tài)。

線粒體跨膜電位法（MMP）檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按實(shí)驗(yàn)要求給各組細(xì)胞加刺激條件或給藥后，將細(xì)胞于含1μmol/L羅丹明123的1 m L PBS中孵育45 min，用冰浴的PBS快速洗滌兩次，置于冰上，熒光顯微鏡下觀察羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)的滯留量。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)的滯留量，取150μL含0.1%Triton的PBS裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至96孔板，于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處測(cè)熒光值。

統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，重復(fù)3次以上。兩組數(shù)據(jù)間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激條件的確定 細(xì)胞分為3組：空白組、Aβ（-）組和Aβ（+）組，各組刺激條件如表2所示。RT-PCR結(jié)果表明，PC12野生型細(xì)胞（空白組）內(nèi)源性IDO的表達(dá)很弱，隨著IFN-γ濃度的升高，IDO的表達(dá)上調(diào)（圖1），且Aβ能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中IDO的表達(dá)（圖2）。當(dāng)刺激條件為25 μmol/L的Aβ和1 000 U/m L的IFN-γ聯(lián)用時(shí)，IDO的表達(dá)量最高，因此將其作為刺激條件。

表2 實(shí)驗(yàn)組刺激條件Tab 2 Stimulus conditions

圖1 Aβ與IFN-γ對(duì)PC12細(xì)胞中IDO表達(dá)的影響Fig 1 The effects of Aβand IFN-γon the expression levels of IDO mRNA in PC12 cells

黃連堿對(duì)Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激后PC12細(xì)胞中IDO m RNA表達(dá)的影響 在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)黃連堿對(duì)IDO的抑制活力比傳統(tǒng)的IDO抑制劑1-MT（1-methyl-tryptophan）更優(yōu)異，其Ki值和IC50值分別為5.8和6.3μmol/L，比1-MT分別低5倍和10倍。而在細(xì)胞水平上，黃連堿的IC50值為7.1μmol/L，比1-MT低2倍［21］。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組：空白組，IFN-γ組（IFN-γ1 000 U/m L），Aβ組（Aβ1-4225μmol/L），Aβ與IFN-γ聯(lián)用組（Aβ1-4225 μmol/L+IFN-γ1 000 U/m L），黃連堿組（黃連堿10μmol/L+Aβ1-4225μmol/L+IFN-γ1 000 U/m L），1-MT組（1-MT 20μmol/L+Aβ1-42 25μmol/L+IFN-γ1 000 U/m L）。結(jié)果表明（圖2），Aβ、IFN-γ或Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激細(xì)胞后，均使細(xì)胞中IDO m RNA表達(dá)量上調(diào)，其中Aβ與IFN-γ聯(lián)用組對(duì)IDO表達(dá)的誘導(dǎo)效果最強(qiáng)，其IDO mRNA表達(dá)量對(duì)比空白組上調(diào)了75%。而在加入黃連堿或1-MT后，IDO表達(dá)量下調(diào)至與空白組相近的水平。

圖2 IDO抑制劑黃連堿對(duì)Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激的PC12細(xì)胞中IDO的mRNA表達(dá)的影響Fig 2 The effects of coptisine on IDO mRNA expression levels in PC12 cells treated by Aβ＋I(xiàn)FN-γ

Hoechst熒光標(biāo)記法檢測(cè)黃連堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組：空白組、Aβ與IFN-γ聯(lián)用組和黃連堿組，各組條件與上述實(shí)驗(yàn)一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Aβ與IFN-γ聯(lián)用組對(duì)比空白組，細(xì)胞貼壁不牢，細(xì)胞核邊緣模糊，染色質(zhì)凝聚，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；而黃連堿加藥組與空白組相似，表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁較牢，細(xì)胞核邊緣清晰，熒光強(qiáng)度與空白組基本一致（圖3）。這一結(jié)果說(shuō)明，黃連堿可有效抑制Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激所引起的PC12細(xì)胞凋亡。

MMP檢測(cè)黃連堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組：空白組、Aβ與IFN-γ聯(lián)用組和黃連堿組，各組條件與上述實(shí)驗(yàn)一致。熒光顯微鏡觀察到（圖4），Aβ與IFN-γ聯(lián)用組細(xì)胞內(nèi)滯留的羅丹明123的熒光強(qiáng)度對(duì)比空白組明顯減弱，而加入黃連堿后，其胞內(nèi)滯留的羅丹明123的熒光強(qiáng)度顯著升高至與空白組基本一致的水平。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果（圖5）顯示，Aβ與IFN-γ聯(lián)用組的熒光值相對(duì)于空白組下調(diào)了約40%，而加入黃連堿后，熒光值對(duì)比Aβ與IFN-γ聯(lián)用組升高30%，與空白組相近。以上結(jié)果均表明，Aβ與IFN-γ聯(lián)用誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，線粒體膜完整性被破壞，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，引起膜電位崩潰，使羅丹明123由線粒體中釋放，從而導(dǎo)致羅丹明123在胞內(nèi)的滯留量減少，而黃連堿能抑制這一現(xiàn)象。

圖3 Hoechst熒光標(biāo)記法檢測(cè)黃連堿對(duì)Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激后PC12細(xì)胞凋亡的影響（×200）Fig 3 The effects of coptisine on PC12 cells apoptosis treated with Aβ＋I(xiàn)FN-γ detected by Hoechst fluorescence labelling method（×200）

圖4 熒光顯微鏡觀察黃連堿對(duì)Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激后PC12細(xì)胞中羅丹明123外排功能的影響（×100）Fig 4 The effects of coptisine on Rhoadmine123 efflux in PC12 cells treated with Aβ＋I(xiàn)FN-γ under fluorescence microscopy（×100）

討論目前關(guān)于IDO與AD關(guān)系的研究基本集中在巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞上，而很少在神經(jīng)元中研究其相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生可能與神經(jīng)元過(guò)早、過(guò)度凋亡有關(guān)。以往的研究通常采用具有代表性和特異性的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元建立模型，但其技術(shù)難度大、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)系統(tǒng)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到了一定限制。我們選擇的PC12細(xì)胞是來(lái)自大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株，屬神經(jīng)嵴源性，用神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）誘導(dǎo)后可長(zhǎng)出突起，具有神經(jīng)元特性，并能克服上述原代培養(yǎng)神經(jīng)元的缺點(diǎn)［1］。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，AD的發(fā)生和發(fā)展與Aβ在神經(jīng)細(xì)胞中的沉積密切相關(guān)。Aβ是一種蛋白質(zhì)多肽，最初于AD患者大腦皮層及海馬的老年斑中被發(fā)現(xiàn)，通常認(rèn)為其與AD的病理改變（如神經(jīng)元丟失和不良性神經(jīng)炎）相關(guān)［8，22］。給成年和新生鼠的大腦皮層內(nèi)注射Aβ，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)神經(jīng)元退行性變化，并引起細(xì)胞凋亡。小膠質(zhì)細(xì)胞通常被認(rèn)為是AD神經(jīng)炎性反應(yīng)的傳遞者，研究表明IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎因子可介導(dǎo)腦部炎性反應(yīng)，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞［19］。另有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以誘導(dǎo)IDO的合成，而IDO參與KP途徑，使血液中色氨酸含量下降，可能與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有關(guān)。Akimoto等［23］發(fā)現(xiàn)，在被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中，系統(tǒng)性的大腦炎性反應(yīng)對(duì)IDO的誘導(dǎo)是必要的；Takikawa等［15］進(jìn)一步證實(shí)IFN-γ與Aβ共同作用可以進(jìn)一步刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，且Aβ對(duì)誘導(dǎo)IDO表達(dá)具有啟動(dòng)效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上IFN-γ能誘導(dǎo)IDO高表達(dá)。根據(jù)上述理論支持，我們采用Aβ1-42和IFN-γ聯(lián)用刺激PC12細(xì)胞，并最終確定兩者工作濃度分別為25μmol/L和1 000 U/m L。

本研究發(fā)現(xiàn)Aβ與IFN-γ聯(lián)用能促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，這提示Aβ與IFN-γ聯(lián)用可能是以凋亡機(jī)制實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的丟失。而預(yù)先加入黃連堿后，細(xì)胞凋亡情況得到逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明黃連堿能對(duì)抗細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。RT-PCR和real-time PCR結(jié)果顯示，Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激后PC12細(xì)胞中，IDO mRNA水平提高了近75%，而預(yù)先加入黃連堿或陽(yáng)性對(duì)照1-MT后，IDO表達(dá)量回落至與野生型PC12細(xì)胞基本一致的水平。由此提示，黃連堿可能是通過(guò)抑制IDO表達(dá)，進(jìn)而降低KP代謝效率，來(lái)抑制神經(jīng)元的凋亡。我們?cè)l(fā)現(xiàn)對(duì)AD具有治療作用的黃連解毒湯在體外對(duì)重組人IDO有較強(qiáng)的抑制效果［18-20］，而黃連堿作為黃連解毒湯的重要成分，是優(yōu)良的IDO抑制劑，可能具有治療AD的潛能［21］。

綜上所述，我們推測(cè)，在Aβ與IFN-γ聯(lián)用刺激的PC12細(xì)胞中，黃連堿可能通過(guò)抑制IDO的表達(dá)，降低KP代謝效率，減少KP中具有神經(jīng)毒性的代謝中間物的生成，從而抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，這為治療AD以及藥物開發(fā)提供了新的思路。

阿爾茲海默癥； 黃連堿； 吲哚胺2，3-雙加氧酶； 細(xì)胞凋亡

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R 592；R 34

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.05.022

2015-02-10；編輯：段佳）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373396），高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20130071110037），上海市科委生物醫(yī)藥重點(diǎn)課題（12431900204）

△Corresponding author E-mail：yangqing68@fudan.edu.cn