程闊菊,景 勝

(1.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，四川達(dá)州 635000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院麻醉科,重慶 400037)

論著·基礎(chǔ)研究

秦皮素對(duì)苯腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響

程闊菊1,景 勝2

(1.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，四川達(dá)州 635000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院麻醉科,重慶 400037)

目的 觀(guān)察秦皮素對(duì)苯腎上腺素誘導(dǎo)的原代SD乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響。方法 建立苯腎上腺素誘導(dǎo)的SD乳鼠原代心肌細(xì)胞肥大模型，觀(guān)察秦皮素對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響；圖像分析法計(jì)算心肌細(xì)胞面積；[3H]-亮氨酸摻入法測(cè)試心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率；實(shí)時(shí)定量熒光 PCR法檢測(cè)心肌細(xì)胞Nrf2和肥大分子標(biāo)志物心房鈉尿肽、心房利尿肽的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 (1)80 μmol/L 苯腎上腺素刺激心肌細(xì)胞48 h能成功復(fù)制SD乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型并伴隨Nrf2表達(dá)量的增加；(2)秦皮素呈劑量依賴(lài)性地抑制苯腎上腺素刺激的SD乳鼠心肌細(xì)胞面積的增大、蛋白質(zhì)合成速率的增加和肥大分子標(biāo)志物的上調(diào)。結(jié)論 秦皮素能顯著抑制PE誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞肥大。

心肌細(xì)胞；脫氧腎上腺素；秦皮素；Nrf2

心肌肥厚是心臟長(zhǎng)期負(fù)荷過(guò)重時(shí)發(fā)生的一種心室重構(gòu)，以心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、細(xì)胞體積增大和心肌細(xì)胞間結(jié)締組織沉積為表現(xiàn)，也是多種心血管疾病，如冠心病、高血壓、心臟瓣膜病等的常見(jiàn)并發(fā)癥和病理基礎(chǔ)[1-2]。盡管心肌肥厚早期是一種代償反應(yīng)，但晚期則逐漸發(fā)展為失代償，常導(dǎo)致嚴(yán)重的心力衰竭、心肌梗死等，最終導(dǎo)致死亡[3]。預(yù)防與逆轉(zhuǎn)這種改變是治療的重要目標(biāo)。研究表明，NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nrf2)對(duì)心肌肥厚及纖維化具有抑制作用，而秦皮素(fraxetin)為Nrf2的天然激動(dòng)劑[4-7]。目前，關(guān)于秦皮素對(duì)心肌肥厚及纖維化是否具有抑制作用的問(wèn)題尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。鑒于此，本研究擬在苯腎上腺素(phenylephrine，PE)誘導(dǎo)的SD乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型基礎(chǔ)上，觀(guān)察秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大作用的影響，以期為心肌肥厚、纖維化及其誘導(dǎo)的心血管疾病提供有效的藥物防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生SD乳鼠(0～2 d)，SPF 級(jí)，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0003。

1.1.2 主要設(shè)備與試劑 CO2培養(yǎng)箱(購(gòu)自SANYO公司)，超凈工作臺(tái)(購(gòu)自JOYN公司)，倒置顯微鏡(購(gòu)自L(fǎng)eica公司)，LightCycler480(購(gòu)自Roche公司)，青霉素、鏈霉素(均購(gòu)自華美生物工程公司)，二甲基亞砜(DMSO)、fraxetin、phenylephrine(均購(gòu)自Sigma公司)，羊血清、胎牛血清(FBS)、DMEMF12(購(gòu)自GBCO公司)，組織固定液(購(gòu)自Alphelys公司)，RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒(均購(gòu)自Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 新生SD乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 無(wú)菌取出新生SD乳鼠心臟，預(yù)冷PBS溶液洗凈心臟殘血，切除兩心耳、心房與右心室，將左心室切成1～2 mm3碎片，加入消化酶液(Gibco胰酶0.15%，Hyclone胰酶0.10%)，以140 r/min的轉(zhuǎn)速于恒溫36.5 ℃下消化10 min，沉淀、吸取上清液，加入20%FBS培養(yǎng)液中終止消化，反復(fù)多次至所有心臟組織消化完全為止。棄第1次消化的上清液，收集余下上清液，40 μmol/L(40 μm：過(guò)濾網(wǎng)規(guī)格)過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，將過(guò)濾細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)90 min，除去貼壁纖維細(xì)胞。90 min后，吸取上清液，經(jīng)濾網(wǎng)再過(guò)濾后，加入終濃度為0.1 mmol/L 的5-溴脫氧尿嘧啶核苷，種置于預(yù)先包被有明膠的培養(yǎng)皿中。5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下孵育48 h，PBS輕柔清洗1次，更換培養(yǎng)基，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)鑒定。

1.2.2 心肌細(xì)胞肥大模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)對(duì)秦皮素設(shè)置5個(gè)濃度梯度，對(duì)PE刺激設(shè)置5個(gè)時(shí)間梯度，秦皮素濃度梯度:0、1.0、2.0、4.0、5.0 μmol/L；PE時(shí)間梯度：0、6、12、24、48 h；模型的建立及藥物處理：心肌細(xì)胞無(wú)血清饑餓24 h，換成分別含0、1.0、2.0、4.0、5.0 μmol/L的秦皮素培養(yǎng)基孵育1 h后，加入80 μmol/L的PE，分別繼續(xù)孵育0、6、12、24、48 h。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 心肌細(xì)胞面積的測(cè)定(圖像分析法) 細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS快速輕柔洗滌細(xì)胞2遍，于倒置顯微鏡下觀(guān)察并拍照。每培養(yǎng)皿取3～5個(gè)視野，每個(gè)視野取5～10個(gè)細(xì)胞，用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件Image-ProPlus 5.0測(cè)定單個(gè)心肌細(xì)胞面積(m2)。

1.2.4 [3H]-亮氨酸摻入法測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率 在離處理結(jié)束12 h時(shí)，每培養(yǎng)皿加入11 μL Ci/mL[3H]-亮氨酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，4 ℃PBS清洗貼壁細(xì)胞2次，用0.2%胰酶將貼壁細(xì)胞消化，收集消化心肌細(xì)胞于預(yù)備好的玻璃纖維膜上。10.0%三氯乙酸分解破碎心肌細(xì)胞，于PBS中清洗3次，除去游離的同位素標(biāo)記物，烘干濾膜。置于含相應(yīng)劑量閃爍液的檢測(cè)瓶?jī)?nèi)，搖勻，液體閃爍儀(Beckman)測(cè)定蛋白質(zhì)合成速率，結(jié)果以cpm表示，[3H]-亮氨酸的摻入量即可反映心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成速率。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Nrf2及心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，按照RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取心肌細(xì)胞總RNA，凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，分光光度儀檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度。按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)將mRAN 反轉(zhuǎn)率成cDNA，用LightCycler 480儀器對(duì)Nrf2及心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和心房利尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增并，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。實(shí)時(shí)定量熒光PCR引物序列如下：GAPDH上游引物序列：5′-GAC ATG CCG CCT GGA GAA AC-3′,下游引物序列：5′-AGC CCA GGA TGC CCT TTA GT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為92 bp;Nrf2上游引物序列：5′-TCT GTC AGC TAC TCC CAG GT-3′,下游引物序列：5′-GAA TAT CCA GGG CAA GCG ACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為148 bp;ANP上游引物序列：5′-ACA CAG CTT GGT CGC ATT GCC A-3′,下游引物序列：5′-CGT CTG TCC GTG GTG CTG AAG TTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為215 bp;BNP上游引物序列：5′-ACA ATC CAC GAT GCA GAA GCT-3′,下游引物序列：5′-GGG CCT TGG TCC TTT GAG A-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為87 bp。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：心肌細(xì)胞剛接種尚未貼壁時(shí)形態(tài)為橢圓形或圓形。1 d后，細(xì)胞伸出偽足開(kāi)始貼壁；2 d后，偽足成纖維條索狀，細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞胞體則呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，如多角形、菱形或梭形，并有少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始聚合(圖1)；3 d后，大部分細(xì)胞已聚合成團(tuán)并成良好搏動(dòng)狀態(tài)，頻率約100次/分鐘。免疫熒光鑒定：心肌細(xì)胞anti-α-actinin 染色成陽(yáng)性，心肌特異性橫紋肌結(jié)構(gòu)明顯可見(jiàn)，且細(xì)胞核周?chē)猩僭S棕黃色顆粒，心肌細(xì)胞純度大于95%，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞面積的影響 經(jīng)PE誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞面積顯著增大(P<0.05)，從12 h起作用，48 h達(dá)最大值，表明80 μmol/L PE刺激大鼠心肌細(xì)胞48 h能成功復(fù)制大鼠心肌細(xì)胞肥大模型；經(jīng)秦皮素預(yù)處理后，PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積增大隨秦皮素呈劑量依賴(lài)性的減輕，從4 μmol/L起可以將其抑制在基礎(chǔ)水平。表明，秦皮素能顯著抑制PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞面積增大，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察

圖2 心肌細(xì)胞免疫學(xué)鑒定

A：不同濃度的秦皮素對(duì)心肌細(xì)胞面積的影響；B：5 μmol/L秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞面積的影響;a：P<0.05，與秦皮素組比較；b：P<0.05，與PE+介質(zhì)組比較。

圖3 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞面積的影響

2.3 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入量的影響 經(jīng)PE刺激誘導(dǎo)后，大鼠心肌細(xì)胞的[3H]-亮氨酸摻入量顯著增多(P<0.05),從12 h起作用，48 h達(dá)最大值，表明80 μmol/L PE刺激心肌細(xì)胞可成功的復(fù)制心肌細(xì)胞肥大模型；應(yīng)用秦皮素預(yù)處理后，[3H]-亮氨酸摻入量顯著減少(P<0.05)，從4 μmol/L起可以將其抑制在基礎(chǔ)水平，表明秦皮素可顯著抑制PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率的增加，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4 秦皮素及PE對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響 經(jīng)PE誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞Nrf2的mRNA表達(dá)量顯著增高(P<0.05)，從6 h起作用，48 h達(dá)最大值；經(jīng)秦皮素預(yù)處理后，PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Nrf2表達(dá)量并不隨秦皮素劑量的改變而變化。表明PE能顯著誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)量的增高，但秦皮素對(duì)其表達(dá)無(wú)影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

A：不同濃度的秦皮素對(duì)心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入量的影響；B：5 μmol/L秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入量的影響；a：P<0.05，與秦皮素組比較；b：P<0.05，與PE+介質(zhì)組比較。

圖4 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸摻入量的影響

A：不同濃度的秦皮素對(duì)心肌細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響；B：5 μmol/L秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響；a：P<0.05，與秦皮素組比較；b：P<0.05，與PE+介質(zhì)組比較；c：P<0.05，與PE+秦皮素組比較。

圖5 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

2.5 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的影響 經(jīng)PE誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物ANP、BNP的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)，從6 h開(kāi)始起作用，48 h達(dá)最大值；經(jīng)5 μmol/L秦皮素預(yù)處理后，已上調(diào)的心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物ANP、BNP的mRNA表達(dá)可回落到基礎(chǔ)水平(P<0.05)(圖6)。表明秦皮素能顯著抑制PE刺激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物的表達(dá)。

A：不同濃度的秦皮素對(duì)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的影響；B：5 μmol/L秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)不同時(shí)間的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的影響；a：P<0.05，與秦皮素組比較；b：P<0.05，與PE+介質(zhì)組比較。

圖6 秦皮素對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的影響

3 討論

在臨床上，心肌肥厚是多種心血管系統(tǒng)疾病的共同病理基礎(chǔ)，如冠心病、高血壓病、心肌炎癥和先天性心臟病等多種心血管疾病。一般情況下，心肌肥厚是多種因素共同誘導(dǎo)的結(jié)果。從廣義上講，誘導(dǎo)心肌肥厚的因素包括兩大類(lèi)，即機(jī)械刺激和神經(jīng)體液分子刺激。機(jī)械刺激包括各種壓力負(fù)荷和容積負(fù)荷的直接刺激。

誘導(dǎo)心肌肥厚的各種神經(jīng)體液分子，目前已報(bào)道的有受體酪氨酸激酶激動(dòng)劑[8]，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β以及血小板源性生長(zhǎng)因子等；G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑[9]，如內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ以及α1-/β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，包括腎上腺素、去甲腎上腺素、PE等；促炎因子如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6、白血病抑制因子及心肌營(yíng)養(yǎng)因子-1等[10]；花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列腺素F2α[11]、蛋白激酶C激動(dòng)劑[12]等。根據(jù)以上心肌肥厚的神經(jīng)體液誘發(fā)分子建立起來(lái)的體外心肌細(xì)胞肥大模型有PE[13]、異丙腎上腺素[14]、內(nèi)皮素-1[15]、血管緊張素Ⅱ[16]、醛甾酮[17]等誘導(dǎo)法。本研究參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)采用80 μmol/L PE刺激心肌細(xì)胞成功的復(fù)制了大鼠心肌細(xì)胞肥大模型。

Nrf2對(duì)心肌肥厚及纖維化具有抑制作用[4-5]，而秦皮素為Nrf2的天然激動(dòng)劑[6-7]。因此，本研究推測(cè)秦皮素對(duì)心肌肥厚及纖維化很可能具有抑制作用。本研究通過(guò)在PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大模型基礎(chǔ)上，觀(guān)察秦皮素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響。結(jié)果表明，秦皮素能顯著抑制PE刺激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞面積增大、蛋白質(zhì)合成的增多以及肥大分子標(biāo)志物ANP、BNP表達(dá)的上調(diào)，證實(shí)秦皮素可以抑制PE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大；在心肌細(xì)胞肥大模型中，Nrf2的表達(dá)量顯著上調(diào)，而秦皮素對(duì)其表達(dá)卻無(wú)影響，說(shuō)明秦皮素的作用靶點(diǎn)可能位于Nrf2蛋白轉(zhuǎn)錄之后而非轉(zhuǎn)錄之前，這一結(jié)論也正好與秦皮素為Nrf2的天然激動(dòng)劑相吻合[6-7]。至于秦皮素抑制心肌肥厚的作用機(jī)制是否通過(guò)Nrf2，以及秦皮素是否對(duì)整體動(dòng)物心肌肥厚模型具有抑制作用，有待進(jìn)一步研究。觀(guān)察秦皮素對(duì)心肌肥厚的作用，并探討其分子機(jī)制，以期為臨床心肌肥厚、纖維化及其誘導(dǎo)的心血管病提供有效的藥物防治。

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Effect of fraxetin on cardiomyocyte hypertrophy induced by phenylephrine

ChengKuoju1,JingSheng2

(1.DepartmentofPharmacy,DazhouCityHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,Dazhou,Sichuan635000,China;2.DepartmentofAnesthesiology,XinqiaoHospitalAffliatedtotheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the effect of fraxetin on primary cardiomyocyte hypertrophy induced by phenylephrine.Methods Primary SD cardiomyocyte hypertrophy was induced by phenylephrine,and we observed the effects of fraxetin on cardiomyocyte hypertrophy induced by phenylephrine.Image-ProPlus 5 measured the area of cardiomyocyte;[3H]-leucine incorporation assay detected the protein synthesis rate of cardiomyocyte;Real-time PCR measured the Nrf2 and molecular markers (ANP,BNP) mRNA expression levels of cardiomyyocyte hypertrophy.Results (1)Primary neonate SD Cardiomyocyte hypertrophy model was successfully established by 80 μmol/L phenylephrine for 48 h,and Nrf2 expression levels significantly increased in cardiomyocyte hypertrophy model;(2)The increase of cardiomyocyte area,protein synthesis rate and molecular markers expression of cardiomyyocyte hypertrophy were significantly inhibited by fraxetin in a dose-dependent manner.Conclusion Fraxetin could significantly inhibit the cardiomyyocyte hypertrophy induced by PE.

cardiomyocytes;deoxye pine phrine;fraxetin;Nrf2

程闊菊(1984-)，藥師，碩士，主要從事心肌保護(hù)方向研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.02.010

R966

A

1671-8348(2015)02-0174-03

2014-07-12

2014-10-22)