張玲萍 綜述，董文斌審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州646000）

活性氧（reactive oxygen species）是指氧自由基和氧化作 用較強的非自由基含氧產(chǎn)物。主要包括超氧陰離子（·O2－）、羥自由基 （·OH）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2）等［1］?；钚匝踉跈C體的免疫過程和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。然而當(dāng)活性氧過多積聚，超過抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激。引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細胞膜、引起蛋白質(zhì)變性、酶活性喪失等損害作用［2－3］；誘導(dǎo)或加重心血管疾病、高血壓、腫瘤、炎癥及肺部疾病的發(fā)生和進展［4］。機體有多種酶體參與活性氧的生成，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧 化 酶（NADPH oxidase，NOX）、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶、黃嘌呤氧化酶、細胞色素P450、一氧化氮合成酶等［1，3］。其中 NADPH 氧化酶是體內(nèi)活性氧生成的重要來源。而p47phox對于激活NADPH氧化酶起著至關(guān)重要的作用。本文主要從p47phox介導(dǎo)活性氧產(chǎn)生及與疾病的關(guān)系方面的進展作一綜述。

1 p47phox的結(jié)構(gòu)

1964年，Rossi和Zatti在吞噬細胞中首次發(fā)現(xiàn)了與呼吸爆發(fā)有關(guān)的NADPH氧化酶。1973年Babior第一次證實了NADPH氧化酶是與活性氧產(chǎn)生有關(guān)的一種酶復(fù)合體，它被激活后，可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧。吞噬細胞NADPH氧化酶是由多亞基構(gòu)成的酶復(fù)合體，它的催化亞基GP91phox又被稱作NADPH氧化酶2（NOX2）［5］。隨著研究的進展，在不同的非吞噬細胞中發(fā)現(xiàn)了GP91phox的同源物，分別稱為：NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2，后來被命名為NOX蛋白家族［6］。

吞噬細胞NADPH氧化酶是由多個亞基構(gòu)成的。包括胞膜組分GP91phox（NOX2）和p22phox結(jié)合而形成的異源二聚體細胞色素b558；胞質(zhì)組分：p40phox、p47phox、p67phox和小分子的GTP結(jié)合蛋白Rac－1或Rac－2（單核細胞為Rac－1，嗜中性粒細胞為Rac－2）。其中反應(yīng)吞噬細胞NADPH氧化酶活性的重要亞基p47phox是胞質(zhì)與胞膜組分之間的連接蛋白，由390個氨基酸組成。其氨基酸序列N末端有一個Phox同源結(jié)構(gòu)域（phox homology，PX），位于氨基酸序列的第4～121。在p47phox磷酸化后，能夠被釋放，與3，4－二磷酸磷脂和磷脂酸結(jié)合，有助于膜定位和NADPH氧化酶的組裝；p47phox氨基酸的中間序列包含2個Src同源3結(jié)構(gòu)域（Src homology 3，SH3）。SH3A位于氨基酸序列的159～214，SH3B位于序列的229～284。SH3A和SH3B之間形成一個淺槽，構(gòu)成肽鏈結(jié)合面。當(dāng)細胞處于靜息狀態(tài)時，這個位點由自動抑制區(qū)占領(lǐng)，以保持細胞處于自動抑制狀態(tài)，當(dāng)p47phox被激活后，這個位點則由胞質(zhì)組分p22phox的富含脯氨酸的區(qū)域（PRR）占領(lǐng)，以保持胞質(zhì)組分與胞膜組分的結(jié)合。p47phox的C末端則包含1個 自 動 抑 制 區(qū) （auto－inhibitory region，AIR）和 至 少 1 個PRR，p47phox的PRR能與p67phoxC末端的SH3域結(jié)合，實現(xiàn)胞質(zhì)組分的組裝［7］，見圖1（圖1參照文獻［8］繪制）。

圖1 p47phox的結(jié)構(gòu)

2 p47phox介導(dǎo)活性氧產(chǎn)生的機制

吞噬細胞NADPH 氧化酶在靜息狀態(tài)下沒有活性或者只產(chǎn)生少量具有生理作用的活性氧。當(dāng)機體受到炎癥因子、生長因子、鈣離子（Ca2＋），以及重金屬、部分藥物等刺激后會被激活，產(chǎn)生大量的活性氧［9－10］。有研究證實，心肌細胞在缺血的狀態(tài)下，細胞內(nèi)活性氧明顯升高，并且p47phox蛋白的表達與活性氧升高程度是相吻合的［11］。當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞受到20 mmol／L的高濃度葡萄糖刺激以后，活性氧的水平較對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）明顯增加，同時胞質(zhì)組分p47phox在胞膜區(qū)域有高表達現(xiàn)象［12］。而在吞噬細胞NADPH氧化酶受藥理抑制或存在p47phox基因缺失的動物模型中，血管的氧化應(yīng)激是減少的［13－14］。

眾多研究證明，p47phox是與吞噬細胞NADPH氧化酶活性有關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子。當(dāng)機體在細胞因子、激素、炎癥等因素的刺激下，p47phox發(fā)生磷酸化，其構(gòu)象發(fā)生改變，分子間的緊密結(jié)合打開，自動抑制區(qū)被釋放，SH3域和PX域暴露出來。接著p47phox富含脯氨酸區(qū)域與p67phoxC末端的SH3區(qū)結(jié)合，而p67phoxN末端能與Rac、p40phox結(jié)合，這就使胞質(zhì)亞基形成了一個復(fù)合體。當(dāng)p47phox完成與胞質(zhì)組分的結(jié)合后，便開始了磷酸化的p47phox攜帶p67phox、p40phox和Rac靠近胞膜。最后p47phox利用N末端2個SH3域之間淺槽樣的肽結(jié)合位點與胞膜組分p22phox的富含脯氨酸區(qū)域結(jié)合，最終實現(xiàn)了胞質(zhì)復(fù)合體與胞膜復(fù)合體在細胞膜上的組裝。這個過程中多個亞基復(fù)雜整合，從而激活了NADPH氧化酶?；罨蟮腘ADPH氧化酶在質(zhì)膜胞質(zhì)面能夠?qū)㈦娮觽鬟f給還原型NADPH，從而將氧分子還原形成單線態(tài)氧（2O2＋NADPH→2O2－＋NADP＋H＋）［15－17］，見圖2。

圖2 NADPH氧化酶活化的機制

3 p47phox與疾病

慢性肉芽腫?。╟hronic granulomatous disease，CGD）是一種吞噬細胞功能障礙的原發(fā)性免疫缺陷病。CGD患兒由于基因突變引起NADPH氧化酶復(fù)合物缺陷，使得NADPH氧化酶不能正?；罨?，產(chǎn)生超氧化物，以殺傷過氧化物酶陽性細菌與真菌。因而出現(xiàn)嚴重的、反復(fù)的細菌和真菌感染。編碼NADPH 氧化酶亞單位gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox的基因分別是CYBB（Xp21）、CYBA（16q24）、NCF1（7q11）、NCF2（1q25）。其中70%的CGD患兒是由于CYBB基因突變而致gp91phox缺乏所引起的。而引起這個疾病第2位的原因是p47phox的缺乏，約占25%；這種突變類型絕大多數(shù)患者NCF1基因缺失2bp，是由野生型基因和假基因重組導(dǎo)致的，患者的p47phox蛋白表達表現(xiàn)出檢測不到的水平。目前，要根治CGD的唯一方法是免疫重建，包括干細胞移植和基因治療。在英美國家，已有p47phox CGD患者基因治療成功的報道［18］。

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的氧化學(xué)說認為，低密度脂蛋白的氧化修飾在促進AS的形成中起到非常關(guān)鍵的作用。它可以攝取巨噬細胞、刺激內(nèi)皮細胞多種炎性因子和黏附分子表達、誘導(dǎo)平滑肌細胞增生。此外，它作為氧化因子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)也會損傷血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞，在高血壓、糖尿病、高脂血癥等引起的動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起重要的作用。NADPH氧化酶是血管內(nèi)活性氧的主要來源，也被證實為是AS進展中活性氧產(chǎn)生的重要來源。p47phox調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活化可產(chǎn)生大量的活性氧，當(dāng)超過機體的清除能力時，過多的活性氧可以通過增加鈣離子水平激活胞內(nèi)信號通路、改變細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)、上調(diào)血管炎性分子的表達、促進平滑肌細胞增殖和低密度脂蛋白的氧化修飾、引起血管收縮性改變，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生與發(fā)展［13］。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，最常受累的是關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為多個關(guān)節(jié)的滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨的破壞。NADPH氧化酶參與了RA的炎性反應(yīng)過程。在關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中含有大量的中性粒細胞和巨噬細胞，在中性粒細胞中，發(fā)現(xiàn)磷酸化的p47phox和NADPH氧化酶活性高度增加。并且，在體外培養(yǎng)RA病理變化的主要功能細胞－成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast－like synoviocyte，F(xiàn)LS）的實驗中，晚期氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）處理FLS，使得FLS內(nèi) NADPH氧化酶被激活，活性氧顯著增加，NADPH氧化酶源性活性氧可以幫助AOPP刺激下游信號，誘導(dǎo)FLS釋放腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、IL－1β、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）等細胞因子。加劇關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)和軟骨的侵蝕，加速RA的進展。而在NADPH氧化酶的激活過程中p47phox起著關(guān)鍵的作用［19］。

肝纖維化是慢性肝損傷常見的后果，也是世界范圍內(nèi)引起死亡的一個重要的原因。肝內(nèi)不同細胞產(chǎn)生的活性氧在肝纖維化進程中起著重要的作用，包括肝星狀細胞、枯否細胞和肝細胞，它們均表達NADPH氧化酶，因此NADPH氧化酶是肝臟內(nèi)活性氧的重要來源。當(dāng)機體受到血管緊張素Ⅱ、纖維化的細胞因子等刺激時，可以誘導(dǎo)p47phox發(fā)生磷酸化，進而產(chǎn)生活性氧。將小鼠的p47phox基因敲除，再結(jié)扎小鼠的膽管（bile duct ligation，BDL）21d，使之出現(xiàn)典型的膽汁淤積型肝損傷；或是給予小鼠肝毒性四氯化碳（CCl4）注射使之出現(xiàn)中毒性肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，p47phox基因敲除的小鼠與野生型小鼠相比，肝纖維化參數(shù)明顯更低?？梢妏47phox基因缺乏的小鼠能抵抗這2種損傷模型誘導(dǎo)的肝纖維化，反之，p47phox在肝纖維化進程中是起著重要的作用［20］。

很多肺部疾病的發(fā)病機制也與NADPH氧化酶有關(guān)的。在肺血管內(nèi)皮細胞內(nèi)表達吞噬細胞NADPH氧化酶，這有助于高氧誘導(dǎo)活性氧生成，促進炎性反應(yīng)發(fā)生和組織損傷。在野生型小鼠的實驗中，觀察到高氧誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肺水腫和中性粒細胞浸潤，而在敲除吞噬細胞NADPH氧化酶基因的小鼠中，這種反應(yīng)是更輕的。這提示吞噬細胞NADPH氧化酶源性活性氧和急性肺損傷之間有一定的關(guān)系。另外，在小鼠肺纖維化損傷模型的進展中需要p47phox的參與，這種纖維化的進程和炎性反應(yīng)有關(guān)。通過對p47phox基因敲除小鼠的研究，將有助于本研究更加深入了解p47phox介導(dǎo)的活性氧在肺纖維化中的作用［21］。

4 p47phox激活NADPH氧化酶的抑制劑

吞噬細胞NADPH氧化酶源性活性氧是機體多個器官活性氧的主要來源。當(dāng)機體受到生長因子，血管緊張素Ⅱ等刺激時，p47phox發(fā)生磷酸化，分子構(gòu)象發(fā)生改變，緊接著引起NADPH氧化酶多個亞基的復(fù)雜整合，激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生大量的活性氧。過多的活性氧能誘導(dǎo)或加重動脈粥樣硬化、高血壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝纖維化等疾病的發(fā)生或發(fā)展，在這些疾病的基礎(chǔ)病理變化中有著不容忽視的作用。因此，需要從源頭上阻止活性氧過多產(chǎn)生，控制氧化應(yīng)激。所以，本研究有更多的理由靶向吞噬細胞NADPH氧化酶，通過對其組織者p47phox功能的抑制，來阻止過多活性氧的產(chǎn)生。

由p47phox與活性氧產(chǎn)生的機制出發(fā)，可以從多種途徑阻斷p47phox激活吞噬細胞NADPH氧化酶，從而減少活性氧的產(chǎn)生。這些途徑包括：（1）阻止或減少p47phox的磷酸化。目前已有研究發(fā)現(xiàn)膠霉毒素可以阻止蛋白激酶C定位到p47phox，來抑制p47phox的磷酸化［22］。（2）干擾p47phox攜帶胞質(zhì)組分向胞膜移位。羅紅霉素可能會干擾胞質(zhì)成分移位到胞 膜［23］，從 而 阻 斷 NADPH 氧 化 酶 的 激 活。（3）抑 制p47phox與胞膜復(fù)合體細胞色素b558結(jié)合。PR－39能與p47phox的SH3域綁定，阻止p47phox與p22phox結(jié)合，這也就阻斷了胞質(zhì)復(fù)合體與胞膜復(fù)合體的組裝，抑制了NADPH氧化酶的激活［24］。除此之外，目前還發(fā)現(xiàn)牛磺酸氯胺，夾竹桃麻素等物質(zhì)能從多個環(huán)節(jié)阻止NADPH氧化酶的激活，減少活性氧生成［16，25］。目前，對這些抑制劑的研究，雖然還未進入臨床階段，但對疾病的治療將提供一個新的靶點。

5 展 望

p47phox是吞噬細胞NADPH氧化酶的一個亞單位，也是調(diào)節(jié)吞噬細胞NADPH氧化酶活性的重要亞基，在NADPH氧化酶源性活性氧的產(chǎn)生中有至關(guān)重要的作用。它主要是通過攜帶胞質(zhì)復(fù)合體向胞膜移位來調(diào)節(jié)活性氧的生成量。通過對這種機制的認識，有助于本研究從源頭上控制過多活性氧的產(chǎn)生，這對于預(yù)防心血管疾病的發(fā)生或其他多種氧化應(yīng)激損傷性疾病是非常有利的。然而，在研究p47phox激活NADPH氧化酶的抑制劑方面，本研究還有很多的未知需要開拓，還有很長的路需要去探索，以期積累更多知識，為臨床預(yù)防和治療氧化損傷提供更多的理論支撐。

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